薄层扫描法(TLCS)

1.1 Kubelka—Munk理论
Kubelka—Munk理论说明了固定相的散射参数对斑点中物质的 浓度与吸光度间关系的影响。该理论的基本方程式如下。 （1）薄层色谱斑点的透射率：
上式是Kubelka—Munk理论描述薄层色谱斑点透光率的最基本公 式。式中Sx是薄层板的散射参数，它与固定相的种类、粒度、薄 层厚度及涂布均匀程度有关。其数值大小直接影响薄层色谱斑点 的吸光度—浓度曲线偏离Beer定律的情况。只有已知薄层板准确 的SX值，才能正确地运用曲线校直法进行薄层扫描定量分析。薄 层色谱斑点中物质的含量包含于a及b两个参数中。
不规则斑点，用直线式扫描定量，即使光带长度适宜，定量误差仍然 较大，因为所得峰面积还与扫描方向有关。
综上所述，直线式扫描较适用于规则圆形薄层色谱斑点及条状薄层 色谱斑点的定量分析。所能测定斑点的大小，以仪器的光带长度为上限。 例CS—930薄层扫描仪，出射狭缝最大长度(高度)为6mm，只能测定小 于6mm的斑点。 在作直线式扫描叫，光带的步进距离ΔY也影响蜂面 积。斑点小应选小步进距离，选择适宜，能降低定量误差。有关TLC及 HPTLC板的光带长度及步进距离的具体选择见表。
反射式
2.1 扫描方式选择
(1) 直线扫描 直线式扫描是用一光带先照射在薄层板的一端，而后作直线 运动至另—端。在作直线式扫描时，实际上是光带固定，薄层板相 对于光带作直线运动。
在作直线扫描时，光带的长度对扫描后所得的色诺峰峰面积 影响很大，下图说明了光带越长，所得的色谱蜂面积越小，反之 则峰面积越大。光带太长，检测灵敏度低，光带太短，光带只通 过斑点的一部分，所得的蜂面积，不能真实反砍斑点的吸收情况。 因此，正常扫描时，应使光带长度略大于斑点直径。在多斑点扫 描的，光带长度略大于最大斑点直径。为了降低定量误差，应使 标准品斑点的直径与检品斑点的直径尽量接近。样品斑点为带状 时，光带长度应约为样带的2/3。
(2)在反射法中薄层色谱斑点的吸收度A：
反射法示意图
1.2 Kubelka—Munk曲线
Kubetka—Munk曲线是以薄层固定相不吸收照射光，即空白板的K ＝0为前提，按照空白板的散射参数，用KubeIka—Munk理论有关 方程式算出斑点的A—KX理论曲线。由于薄层固定相颗粒的散射作 用，对于透射法及反射法造成偏离Beer定律的影响正好相反，故需 按两种情况讨论。 （1）透射法的Kubelka—Munk曲线
应用时应注意： 应用时应注意： 曲线校直法是一种简便的薄层扫描定量校准方法，但比较粗 糙，且有时难于准确知道薄层板的SX值。为了降低定量误差， 应使标准品的色谱峰峰面积与待测品(供试品)的色谱峰面积尽量 接近为好。
2. 薄层吸收扫描法的扫描方式及条件的选择
薄层吸收扫描法的扫描条件，包括扫描方式、波长及测光方式 等。扫描方式分为直线式及锯齿式扫描。扫描波长的选择至关重要， 不仅关系检测灵敏度，而且关系干扰的排除等。测光方式分为透射式及
理想的空白薄层板(简称空白板)的单位薄层厚度的吸光系数K＝0。 事实上，一般空白板K≠0。为了消除此影响，通常在薄层扫描中都是 以空白板为基准，测定相对透光率及相Байду номын сангаас反射率来计算薄层色谱斑点的 吸光度。 (a)在透射法中薄层色谱斑点的吸光度：
上式中i及i0分别为透过斑点及空白板的透射光光强，I0为照射光光强。 T与T0分别为斑点及空白板的透射率。
二、基本原理与方法
薄层扫描法可分为薄层吸收扫描及薄层荧光扫描 两类方法。 1. 薄层吸收扫描法的基本原理
薄层吸收扫描法是用可见光或紫外线的单色光照射展开后 的薄层色谱板，测定薄层色谱斑点(简称斑点)的吸光度(A)随展 开压离(L)的变化，而获得A—L成A—Rf曲线，即薄层色谱扫描 图(简称扫描图)。 曲线上的色谱峰峰面积可用于定量分析。由于薄层板存在 着明显的散射现象，而使斑点中物质的浓度与吸光度的关系不 服从Beer定律，需田Kubelka—Munk(古柏尔卡—曼克)理论来描 述。该方程式是薄层扫描法的定量分析基础。定量校正方法可 分为曲线校直法及非线性回归法等。
式中的X为薄层厚度， SX含义同前，K为单位薄层厚度的吸光系数。 K虽称为“吸光系数”是因“单位厚度”而得名，它与分光光度法 中物质的吸收系数不向，与薄层色谱斑点中物质的浓度有关。KX称 为吸收参数，相当于薄层色谱斑点单位面积中物质的含量(ug／cm2)。
（2）薄层色谱斑点的反射率(R)
(3)薄层色谱斑点的吸光度(A)
2.2 波长选择
波长选择适宜不仅可以提高灵教度，在双波长法印还可排除干扰 并可使基线平直，因而波长选择关系重大。单波长与双波长法的波长 选择分述如下。 (1)单被长薄层扫描法 用一种波长的单色光进行薄层扫描的方法称为单波长薄层扫描法， 简称单波长法。用单波长法所得的薄层色诺扫描图是A－Rf或A－L曲 线。通常选λmax为测量波长，以增加检测灵敏度。单波长法较适用于 分离度较好，无背景干扰的薄层色谱的扫描，否则基线波动较大 (2)双汉长薄层扫描法 用两种波长的单色光交替照射薄层板，测定斑点对两种波长的单 色光的吸光度之差称双波长薄层扫描法，简称双波长法。所得的薄层 色谱扫描图是ΔA－Rf或ΔA－L曲线。
(3) 双校长法的优点 a.可以排除分离度不佳的两个斑点间的相互干扰，能用于分离 度不佳以至于完全重叠斑点的定量分析。 b.可以排除背景污染的干扰，使基线平直。 c.可以提高灵敏度。 d.可以改变色谱峰的倒正。 这些优点的实现，主要取决于波长对的选择。
排除背景污染的干扰
排除两个斑点间的相互干扰
三、使用中应注意的问题
用曲线校正法校直Kubelka—Munk曲线，必须巳知薄层板的SX值， Mrck预制硅胶板的SX＝3，Merck预制氧化铝板的SX＝7，Wako预制 硅胶FM(硅胶GF254)板的SX＝7。国产预制薄层板及自制薄层板，可 参考上述数据试调，而后检查校正是否适宜，修正SX值再校，直至 A—KX曲线成直线为止。检查方法如下图所示。图中点样量显(横坐标) 常用单位为ug/点。
• • • • • 正确选择测量波长与参比波长 在正确的位置用正确的波长设置零点 设置正确的扫描范围 用程序扫描时精确测量斑点的间隔 保证足够的扫描长度
薄层扫描法
一、.双波长薄层色谱扫描仪 1 光学系统
主要包括光源(氘灯与钨订)、单色器(入口狭缝．出口狭缝、光栅等)．以 及检测器(监测光电倍增管、反射和透射测定光电倍增管)组成。
2 主要功能
(1)可进行物质的紫外-可见原位吸收光谱测绘 紫外-可见吸收光谱既可作为物质定但的参考，又可提供待测物质的最 大吸收波长，以便进行色谱测定。 仪器在记录吸收光谱时，可提供两种方式。一种为标准方式(NORMAL)， 这种方式记录光谱进行波长扫描时，所测得光谱数据，一方面存入文件中， 同时也输出到记录器上。另一种方式为差示方式(DIFFERENCE)．它可将 测得光谱数据减去文件中存贮的光谱数据，并将其差值只输入到记录器中， 而不存贮在文件里。 要想得到校正过基线的正确光谱，应这样进行：先以标准方式，在巳展 开过的荡层板上无斑点的空白位置上，进行一次波长扫描，将基线光谱(它 反映空白板对各种技长光的吸收情况)存入文件中(亦可输出到记录器去)。 然后再用差示方式对待测斑点进扣波长扫描，就能得到扣除薄层空白板吸 收的待测物质的正确光谱图。 (2) 多通道自动扫描 仪器提供的程序方式(PROGRAM)，可完成冬通道 的自动扫描。程序方式中有七种参数供使用。它们包括波长1和波长2，用 来分别设定测量波长和参比波长，可以进行双波长扫描。
（2）反射法的Kubelka—Munk曲线
对比两图很易发现，由于薄层固定相的散射作用使在透射法中 所测得的斑点的吸光度产生正偏差，而在反射法测定时产生负偏差。 这是因为照射光被散射，降低了透射率，吸光度增加；散射光增加 了反射光光强，增加了反射率，而降低了吸光度的缘故。其次，还 可发现后图比前图的横座标大25倍，这说明了反射法的灵敏度(响 应值)比透过法小。
(2)锯齿式扫描 用截面积为正方形的光束照射薄层板，光束的运动轨迹为矩齿形。
CS系列的摆动距阂最大为30mm，因此锯齿式扫描适用于直径小于30mm的斑 点。
在做锯齿形扫描时，由于光束来回通过斑点，吸光度积分值 比直线式扫描大， 重复性较好。 锯齿扫描还适用于不规则斑点的定量。虽然扫描方向不同时， 所得的色谱峰形状有差别，但积分值差别较小。 机械锯齿式描仪器扫描速度慢是其缺点，飞点扫描型仪器(如 CS－9000型薄层扫描仪)则克服了此缺点。
1.3 Kubelka-Munk曲线校直
Kubelka－Munk曲线说明了薄层色谱斑点的吸光度与其浓度间 呈非线性关系，该曲线是薄层扫描法进行定量分析的理论依据。曲 线处理采用两类方法：曲线校直法及计算机回归法(线性及非线性 回归)。CS系列仪器采用前者，CAMAG仪器采用后者方法。 曲线校直法是根据薄层板的散射参数SX值，将Kubelka－Munk 曲线校正为直线，简化A与KX间的关系，以利于定量分析。