产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛抗原成熟肽的克隆表达及部分免疫学特性的分析

Ｋ ９Ｐ Ｒ 产 物 经 回 收 纯 化 后 ， 隆 到 ｐ Ｓ—Ｔ 载 体 上 ， ９ Ｃ 克 Ｂ 转 化 ｔｐ０感 受 态 细 胞 ， 取 白 色 菌 落 Ｉ 。 经 Ｐ Ｒ 鉴 定 ， ｏｌ 挑 ５ Ｃ 并 用 Ｘ ｏ 和 ＮｃＩ 酶 切 鉴 定 重 组 质 粒 ， 北 京 奥科 生 物 技术 ｈＩ ｏ双 送 有 限公 司进行 测序 ， 步鉴 定为 阳性 的克 隆 ， 名为 ｐＳ ９。 初 命 Ｂ —Ｋ ９
和 原核 表 达 载体 ｐ 一２ ａ由本 实 验 室保 存 。 ＥＦ ８
（Ｈ ７ ４ 洗 涤 ２次 ， Ｐ Ｓ重 悬 沉 淀 。 加 入 等 体 移 ２×Ｓ Ｓ ｐ ．） 用 Ｂ １ Ｄ
—
ＰＧ Ａ Ｅ上 样 缓 冲液 ， 悬 混 匀 ，０ ℃ 煮 沸 ６ｒｉ， 行 Ｓ Ｓ 重 １０ ｌｉ ｌｌ 进 Ｄ
试验， 为进 一 步对 幼 畜腹 泻疫 苗的 研 制 奠 定基 础 。
关 键 词 ： 肠 杆 菌 Ｋ９ ； 大 ９ 茵毛 抗 原 ； 隆 表 达 ； 疫 学特 性 分 析 克 免 腹 泻是 影 响 畜牧 业 发 展 的 重要 疫 病 ， 因肠 毒 素性 大 肠 杆 菌 引 起 的新 生 幼 畜 腹 泻 发 病 率 高 达 ３ ％ ～ ５ ％ ， 亡 率 达 ０ ０ 死
０ ２ｍｌ只 。 ． ／
存， 其它 为 国产 分 析 纯 级 产 品 。引 物 参 考 Ｇ ｎ ａｋ上 的 Ｉ ９ ｅＢ ｎ （ ９ 菌 毛编 码 序 列 （ 列 登 号 ： ５ ８ ）设 计 扩 增 全 长 引 物 ， 序 Ｍ３２ ２ ， 并
在引物的两端设 计酶切位点 。引物序列 如下 ：
特 异 性 菌 毛 介 导 的【 。 这 种 Ｅ Ｃ特 有 的 菌 毛 与普 遍 存 在 ３ ｊ ＴＥ 于 大肠 杆菌 的 Ｉ型 菌 毛 不 同 ， 常 称 为 黏 附 素 或 定 居 因 子 通 （ｏ ｎ ａｉ ｃ ｒ ｃｌ ｉ ｔ ｎｆ ｔ ）。 猪源 产肠 毒 素 性 大 肠 杆 菌 的 黏附 素 抗 ｏｚ ｏ ａｏ 原 主要 有 Ｋ ８ Ｆ ）Ｋ ９ Ｆ ）９ ７ （ ８ 和 Ｆ １ 肠 毒 素 包 括 ８ （ ４ 、 ９ （ ５ 、８ Ｐ Ｆ ） ４， 耐 热肠 毒 素 与 不 耐 热 肠 毒 素 。 我 国 仔 猪 腹 泻 病 原 黏 附 素 ｓ ％ 以上 是 Ｋ ８ｃ ， 牛 羔 羊腹 泻 病 原 的 黏 附 素 中 Ｋ９ ０ ８ａ 型 犊 ９及 Ｆ １相 加 占 ５ ％以 上… 。 而本 实 验 室 已构 建 好 Ｋ ８ｃ Ｔ Ｉ ４ ０ ８ ａ —Ｓ Ｉ 基 因 工 程菌 株 ， 并 基 工 程 表 达 的 融 合 Ｋ ８ｃ Ｔ Ｉ 合 ８ ａ —ｓ Ｉ 混 试 验剂 量 的 ＬＦ 作 为试 验 疫 苗 免 疫 小 鼠 ， 果 能 很 好 地 诱 Ｂ 结 导 小 鼠产 生 抗 Ｋ ８ ｃ ＴＩ 的抗 体 ， 以抵 抗 ２ Ｄ细 菌 数 ８ ａ —Ｓ Ｉ 可 ＭＬ
ｐ ＥＴ 一 ２ ８ａ— Ｋ９９。
程 菌株 对 预 防仔 猪 腹 泻 也 具 有 重要 作 用 。
１７ 重组蛋 白的诱导 表达和 Ｗｅｔｒ ｌｔ 测 ． ｓ ｎｂｏ 检 ｅ
鉴 定 正 确 的 阳性 克隆 接 种 于 含 Ｋ ｎ ５ ｇｎ ） 液 体 ａ （０ ／ｄ 的 Ｌ Ｂ培 养 基 ，７ 培 养 到 ＯＤＩ值 至 ０ ８左 右 ， Ｉ＇ 终 浓 ３℃ ６） ｌ ｛ ． 经 ＰＦ Ｇ（
１ ２ 酶 及 其 它 试 剂 ．
Ｒ ＮＡ酶 、 Ｎ Ｐ Ｔ ｑＤ Ａ 聚 台 酶 ， 购 自上 海生 工 生 物 ｄ Ｔ 、 ａ Ｎ 均 工程 技 术 服 务 有 限 公 司 ； 制 性 内 切 酶 （ ｈ Ｉ Ｎ ｏ ） 限 Ｘ ｏ 、 ｃ Ｉ 为
Ｐ Ｇ 分 离 胶 浓 度 １ ％） 文 献 介 绍 的方 法 初 步 纯 化 蛋 Ａ Ｅ（ ２ 按 白 ６。样 品经 Ｓ Ｓ—Ｐ Ｇ 】 Ｄ Ａ Ｅ后 ， 电 转 移 至硝 酸 纤 维 膜 上 ， 经
—
按 文 献 介 绍 的方 法进 行 Ｗｅｔ ｎ ｂ ｔ ］ ｓ ｒ ｌ Ｉ 。用 封 闭液 窒 温 封 闭 ｅ ｏ７ １ｈ 加人 １ １ ０倍 Ｐ Ｓ一 Ｆ稀 释 的 Ｋ９ ， ：０ Ｂ ９阳性 血 清 ，７ 作 用 ３℃
Ｐｏ ｅａ 司 产 品 ， 自： 天 为时 代 有 限 公 司 ； 根 过 氧 化 ｒｍ ｇ 公 购 化京 辣
度 １ｍ ｌＬ 诱 导 ５ ８ ｈ后 ， ０ ／ ｎ离 心 ２ ｒｉ， Ｂ ｍｏ／ ） ～ ８０ ０ ｒ ｍｉ ｎＰ Ｓ ａ
１ 材 料 与 方 法
１ １ 菌 株 和 质 粒 ．
Ｃ ３ １ Ｋ９ ） 于 中 国兽 医 药 品 监 察 所 ；Ｂ ８ ９ ２（ ９ 购 ｐ Ｓ—Ｔ 载 体 购 自北 京 天 为 时代 有 限公 司 ；８ ９ ２菌 株 、 Ｌ １ Ｄ ３ Ｃ ３１ Ｂ ２ （ Ｅ ）菌 株
（１新疆石河 子大学 动物科 技学 院 ８ ２ ０ ２新疆 地方 与 民族 高发病 重点实验 室 ８ ２ ０ ） ３０３ ３ ０ ３
【 要 】采 用 Ｐ Ｒ方 法 ， ８ ９２ 含 Ｋ ９ 标 准株 茵 液 为模 板 扩 增 Ｋ ９茵毛 基 因 ， 隆 至 ｐ Ｓ 摘 Ｃ 以 ３１（ ９） ９ 克 Ｂ —Ｔ 载 体 。提 取 阳
１ ％～３ ％ ， 济 损 失 巨 大 … 。药 物 治 疗 幼 畜 腹 泻 效 果 不 ０ ０ 经
１ ３ 买 验 动 物 ． 实 验 用 小 鼠 （７ ２ｇ 购 于 石河 子 大学 实 验动 物 中 心 。 １ ～２ ）
１４ Ｐ ． ＣＲ扩 增 目的 基 因
培 养 １ ０ｈ的 Ｃ ３ ０ ８ ９ ２菌 液 作 为 Ｋ９ ９基 因 Ｐ Ｒ 扩 增 的 模 Ｃ 板 。Ｐ Ｒ 扩 增 体 系 ：０×ｂｆ ｒ２ ｌＫ ９上 、 游 引 物 各 Ｃ １ ｕ ｅ ， ９ ｆ 下
果 也不 理 想 。基 因 工 程 疫 苗 具 有 副 作 用 小 、 全 、 效 等 特 安 高
点 成 为 新型 疫 苗 的研 究 方 向 。
Ｄ ＮＡ聚合 酶 ０ ３ ｐ （ ｔ） 去 离 子 水 补 足 到 １ ． ｌ ． ． ５ Ｕ／ ， １ ｄ ３ ９” 。扩
产肠 毒 素 性 大肠 杆 菌 （ Ｔ Ｃ 的毒 力 因 子 主 要 包 括 黏 附 Ｅ Ｅ ）
０ ３ｔ ｄ ． Ａ，ＮＴＰ ０ ８ ｔ Ｍｇ ２１ ２ ｔ Ｋ９ Ｒ 模 板 ｌ／ ， ｑ ． Ａ， Ｃｌ ． Ａ， ９ ＰＣ ＊ Ｔａ １
好 ， 易 产 生耐 药 性 ， 而 免 疫 预 防 是 最 佳 选 择 。国 内外 曾 且 因 采 用灭 活 疫 苗或 自场 活 苗 等 免 疫 妊 娠 母 畜 ， 副 作 用 大 ， 但 效
１ ９ 重 组 蛋 白 间接 ＥＬ Ｓ 法 检 测 抗 体 ． ＩＡ
＊ 为 通讯 作 者 。
基金项 目： 疆生 产建 设兵 团博 士基 金 （ 新 兵博 ０ ）Ｎ Ｂ Ｓ Ｔ￣） ２ （ Ｋ ＯＩＨ＿ 。 ￣
分 别 于 免 疫 前 、 １ 免 疫 后 １ 、 ２次 免 疫后 １ 、 第 次 ４ｄ 第 ４ｄ 第 ３次 免 疫 后 １ ， 用 间 接 Ｅ ＩＡ检 测 各组 小 鼠血 清 中的 ４ｄ 应 ＬＳ
维普资讯
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２ ８・
《 海畜牧兽 医通讯》 ２ ０ 上 ０ ８年 第 ３期
产 毒 性 肠 菌 ９菌 抗 成 肽 克 表 及 分 疫 特 的 析 肠 素 大 杆 Ｋ 毛 原 熟 的 隆 达 部 免 学 性 分 ９
姜 文 亿 盛 金 良 王 远 志 陈 创 夫
索 、 毒 素 、 肿 病毒 素 、 肠 水 内毒 素 、 血素 以及 Ｅ ｔ 。其 中 黏 溶 ａ Ａ
附素 和 肠 毒 素 在 发 病 学 和 免 疫 学 方 面 起 很 重 要 的 作 用 【 。 ２ ｊ Ｅ 、Ｃ定 居 宿 主 小 肠 上 皮 细 胞 的 能 力 是 由 菌 体 表 面 的 宿 主 １ Ｅ
的 大肠 杆 菌 强 毒 株 Ｃ ３ １ ８ ９ ５的攻 击 【 ， 此 构 建 Ｋ ９基 因 工 ｜ 因 ］ ９
１６ 表 达载体 的构建 和测序 ．
用 Ｘ ｏ 和 Ｎ ｏ 双酶 切 ｐ Ｓ—Ｋ ９重 组 质 粒 ， Ｋ ９片 ｈＩ ｃＩ Ｂ ９ 将 ９ 段 切 下 回 收 ， 克 隆 到 相 同 内 切 酶 处 理 过 的 ｐ Ｔ 一２ ａ 核 亚 Ｅ ８原 表 达载 体 上 ． 化 Ｂ ２ （ Ｅ ） 受 态 细 胞 。 经 Ｐ Ｒ 鉴 定 ， 转 Ｌ１Ｄ ３感 Ｃ 并 用 ＸｈＩ ＮｃＩ 酶 切 鉴定 重 组 质 粒 ， 北 京 奥科 生 物 技 ｏ和 ｏ双 送 术 有 限 公 司 进行 序列 测 定 ， 步 鉴 定 为 阳 性 的 克 隆 ， 名 为 初 命
性 质粒 ， 行 Ｐ Ｒ 和 酶切 鉴 定 。经 测 序 正 确后 ， 建 原核 表 达 载 体 ｐ Ｔ一２ ａ 进 Ｃ 构 Ｅ ８ —Ｋ９ ， 重组 质 粒 转 入 大肠 杆 菌 Ｂ ２ ９将 Ｌ１ （ Ｅ ） ， ＩＴ 诱 导表 达后 ， 体蛋 白经 Ｓ Ｓ Ａ Ｅ， 约 １ 有 一 明 显 特 异性 条 带 ， 达 产物 经初 步 纯化后 ， Ｄ ３中 经 Ｐ Ｇ 茵 Ｄ —Ｐ Ｇ 在 ８Ｋｕ 表 免 疫 印迹 法 （ ｓｅ ｌ ｔ ｇ 分 析证 实， 重组 蛋 白与 Ｋ ９阳性 血 清 发 生特 异 性 反 应 。 然 后 将初 步 纯化 的 重 组蛋 白 Ｗｅｔ ｎｂ ｔ ｎ ） ｒ ｏｉ 此 ９ 免 疫 实验 兔 ， 设 对 照组 ， 立 间接 Ｅ ＩＡ 法进 行 抗 体 检 测 ， 析表 达产 物 的抗 原 性 和 免 疫原 性 ， 对 各 组进 行攻 毒 并 建 ＬＳ 分 并
１ｈ 然后 用 ＤＡＢ避 光 显 色 ． ， 以上 洗 涤 都 用 Ｐ Ｓ Ｂ Ｔ。
１ ８ 动 物 免 疫 ．
３ ０只雌 性 小 鼠 随 机 分 为 ３组 ， 组 ｉ 每 ０只 。第 一 组 用 预 制疫 苗 免 疫 ，、 ／ （ 纯 化 蛋 白 Ｋ ９４ ｇ 加适 量 不 完 ０ ２ｍｌ只 含 ９ ０ｕ ， 全弗 氏佐剂） 第 二组 只用纯 化蛋 白 Ｋ ９免疫 （ ； ９ 含纯 化蛋 自 Ｋ９ ０ ｇ ， ． ／ ， 三 组 用 Ｐ Ｓ免 疫 （ 对 照 ） ９４ ） ０ ２ ｍｌ只 第 Ｂ 为 ，
０ ８年 第 ３期
Ｋ９ ９特 异 性 抗体 。 间接 Ｅ ＩＡ测 抗 体 主要 过 程 为 ： 纯 化 的 ＬＳ 用 ５￣ ／ 重 组 Ｋ ９蛋 白 包 被 ９ ｇ ｍｌ ９ ６孔 酶 联 反 应 板 ， ０ １孑 ， １０ ／Ｌ ３ ℃ 作 用 ２ｈ后 ， ４ ７ 置 ＂ 夜 ； ２ 胎 牛 血 清 的 Ｐ Ｓ 进 行 Ｃ过 用 ％ ＢＴ
Ｋ ９ｐ５ 一 Ｃ Ｔ ＧＧ Ａ Ｔ Ｔ ＡＡ ＴＴ ＡＡ ＧＧ 一 ’Ｎｄ ９ｕ：’ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ ３ （ｅ ）
Ｋ９ｏｎ５ （ Ｇ Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ａ ＴＧ Ｃ Ａ Ａ Ｇ ３（ｈ１ ９ｄ ： Ａ ＡＣ ＴＡ Ａ Ｇ Ａ Ｔ ＡＧ ＡＧ 一 ’ ０ ｗ Ｔ Ｘ ）
物 酶标 记 的 羊抗 鼠 ＩＧ 和显 色 剂 ＭＢ购 于北 京 博 奥 森 生 物 ｇ Ｆ 技 术有 限公 司 ； 接 Ｅ Ｉ Ａ 的 Ｘ ９阳 性 血 清 由本 室 制 备 保 同 ＬＳ ９
１ｈ加 人 １２０ ０倍 稀 释 Ｈ Ｐ一山 羊 抗 兔 一ＩＧ，７ 作 用 ， ： ０ Ｒ ｇ ３℃
增 参 数 ：５ ℃ 预 变 性 ４ ｒｉ，４ ℃ ３ ，７℃ ４ ，２ ℃ ９ ｎ９ ａ ０Ｓ ５ ０ Ｓ７ ４ ， ０个 循 环 ，２℃ １ ｕ。经 １ ０ ０Ｓ３ ７ ０ ｍｉ ． ％琼 脂 糖 凝 胶 电泳 分
析 Ｐ ＣＲ产 物 。
１５ 重 组 克 隆 载 体 的 构 建 和 筛选 ．