缺血后适应对脑缺血树鼩海马TLR4表达的影响

缺血后适应对脑缺血树鼩海马TLR4表达的影响
冯蕊;李树清
【摘要】目的:观察血栓性脑缺血树鼩海马Toll 样受体4(TLR4)表达的改变,进一步探讨缺血后适应对海马TLR4表达的影响.方法:用光化学法建立血栓性脑缺血模型;并于缺血4 h夹闭缺血侧颈总动脉5 min,再通5 min,重复3个循环,实施后适应处理.用HE染色观察海马组织学改变,Western blotting测定海马TLR4蛋白表
达,RT-PCR测定海马TLR4 mRNA.结果:脑缺血4、24、72 h海马神经元损伤进行性加重,24 h达高峰,后适应后损伤减轻.脑缺血海马TLR4蛋白表达明显增强(P＜
0.05).与脑缺血组比较,后适应4 h及24 h TLR4蛋白表达减少(P＜0.05),后适应72
h TLR4蛋白表达增加(P＜0.05).海马TLR4 mRNA的表达趋势与蛋白表达基本一致.结论:脑缺血时海马TLR4表达明显增强,缺血后适应的脑保护机制可能与调控TLR4表达有关.%AIM : To observe the effects of thrombotic cerebral ischemia and postconditioning on the expression of toll - like receptor 4 ( TLR4 ) in hippocampus of tree shrews.METHODS : The model of thrombotic focal cerebral ischemia was established by photochemical reaction.Four hours after the onset of photochemical reaction, ischemic postconditioning was induced by 3 repeated cycles of carotid artery occlusion for 5 min and reperfusion for 5 min.The histological changes of hippocampus ( by HE staining ), TLR4 protein level ( by Western blotting ) and TLR4 mRNA expression ( by semiquantitative RT - PCR ) were observed.RESULTS: The extensive neuronal degeneration in hippocampus was observed from 4 h to 72 h and peaked at 24 h after cerebral ischemia, but was significantly attenuated after postconditioning.Cerebral ischemia
caused a progressive increase in the expression of TLR4 protein at 4 h and 24 h ( P ＜ 0.05 ), and decreased at 72 h ( P ＜ 0.05 ).In contrast to ischemia groups, postconditioning decreased the expression of TLR4 protein at 4 h and 24 h ( P ＜0.05 ), but an increase in the expression of TLR4 at 72 h ( P ＜0.05 ) was observed.Simultaneously,the level of TLR4 mRNA in hippocampus showed the tendency of approximate variation in accordance with the protein expression.CONCLUSION : The expression of TLR4 increases by cerebral ischemia.The protection mechanisms of postconditioning may be associated with modulating TLR4 expression.【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2011(027)006
【总页数】5页(P1048-1052)
【关键词】脑缺血;Toll;样受体4;缺血后适应;海马;树鼩
【作者】冯蕊;李树清
【作者单位】昆明医学院第一附属医院风湿免疫科,云南,昆明,650031;昆明医学院病理生理学教研室,云南,昆明,650031;昆明医学院病理生理学教研室,云南,昆
明,650031
【正文语种】中文
【中图分类】R363
脑缺血所导致的炎症瀑布反应在脑损伤中具有重要作用，其机制迄今尚不明了。

已
知固有免疫(innate immunity)可影响脑缺血后炎症反应，表现为快速而相对直接的炎症反应，可与修饰后的内源性抗原分子相互作用［1］。

Toll样受体(Toll－like receptor，TLR)则是固有免疫的核心作用因子［2］。

国外最新研究［1，3］认为 TLR与缺血耐受/免疫耐受密切相关，阻断TLR及炎症细胞因子信号途径有助于脑和其它器官的缺血耐受。

免疫耐受的可能机制是影响了TLR/细胞因子途径，在刺激机体炎症反应的同时也激发了机体抵抗炎症反应的防御机制。

最近有关TLR 在脑缺血中生物学作用的研究备受关注，但与后适应的相关研究尚未见报道。

本研究以光化学法诱导树鼩血栓性脑缺血模型，观察血栓性脑缺血时海马的病理组织学改变，并定量检测缺血后适应对脑缺血不同时间海马TLR4蛋白及mRNA表达的动态改变，探讨后适应的脑保护作用是否与调控TLR4表达有关，为临床缺血性脑疾病的防治开辟出一条新的保护途径，具有重要的实践意义。

材料和方法
1 动物
健康成年树鼩126只，雌雄不限，体重(120±20)g，昆明医学院动物实验中心提供。

整个实验过程均由昆明医学院实验动物伦理委员会批准、监督与检查。

避光、清洁、安静环境饲养，随机分为假手术组(sham)、缺血4 h 组(ischemia 4 h，I 4 h)、缺血24 h组(ischemia 24 h，I 24 h)，缺血 72 h组(I 72 h)、缺血后适应4 h组(IP 4 h)和缺血后适应24 h组(IP 24 h)和缺血后适应72 h组(IP 72 h)，共计7个组，每组6只。

实验动物术前及术后自由进食进水。

2 树鼩血栓性脑缺血模型的建立
按照李树清等［4］的方法，使用脑血栓形成装置建立树鼩局灶性脑缺血模型。

以1%硫喷妥钠(5 mg·kg－1)腹腔注射麻醉动物，矢状切开头皮1 cm，细心分离部分颞肌以暴露顶区颅骨，用一块含直径0.5 cm窗孔的铝片屏蔽照射区，铝片周围使用遮光纸遮盖保护。

实验组动物经舌下静脉一次性注射孟加拉红生理盐水(1.33
mL·kg－1)，循环10 min后，将动物置于SQ－Ⅲ型光化学诱导脑血栓形成装置下，使光束透过铝片窗孔直接照射于颅骨表面，在光强度1W.cm2下照射15 min，照射期间维持颅骨表面温度于(36±1)℃。

术后取出铝片，消毒并逐层缝合切口，
放入饲养笼，被盖以保持体温。

假手术组按规定剂量注射孟加拉红而不予光照处理。

各组动物术后待清醒后自由进水、进食。

实验后4 h、24 h及72 h分别取材、观察。

3 缺血后适应模型的建立
按照李树清等［4］的方法，于光化学法血栓性脑缺血模型复制成功后，在缺血4 h时点前40 min，用1%硫喷妥钠(2.5 mg·kg－1)重新麻醉动物，分离缺血侧颈
总动脉，在缺血4 h时点前30 min以无创动脉夹在甲状软骨上缘平面夹闭颈总动脉，5 min后去除动脉夹再灌注5min，如此夹闭－打开共计重复3个循环，共用时30 min。

术后缝合动物颈部创口，保暖回笼，待清醒后自由进水、进食。

实验
后4 h、24 h及72 h分别取材、观察。

4 脑组织灌注与内固定
脑缺血后不同时点(4 h、24 h、72 h)或后适应后不同时点(4 h、24 h、72 h)再次麻醉动物，固定动物于手术台板上，用眼科剪剪开腹腔，打开胸腔，剪开心包结扎降主动脉，自心尖部插入一聚乙烯管，使其进入升主动脉，扎闭主动脉根部以防回流，剪开右心耳，灌注预冷的生理盐水100 mL，待肝脏变白后，再换为在120 mmHg压力下缓慢滴注固定液10%甲醛200 mL行内固定2 h。

固定完毕打开颅骨，取脑，再浸泡于10%甲醛中后固定24 h，脑组织与固定液之比为1∶20。

常
规脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋制作蜡块标本，保存于4℃冰箱备用。

行HE染色作光镜检查。

5 Western blotting定量检测TLR4蛋白的表达
BCA法总蛋白质含量测定。

95℃裂解3－5 min，使蛋白质变性。

SDS－PAGE垂
直电泳120 V、90 min分离蛋白质，并转膜100 mA、150 min，5%脱脂牛奶37℃封闭30 min。

TLR4抗兔多克隆抗体(1∶600，sc－30002，Santa Cruz)或
β －actin抗鼠单克隆抗体(1∶5 000，Abcam)4 ℃孵育过夜，0.1%TBST(Tris－buffered saline－Tween－20)洗 3次，每次15 min，辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗(1∶5 000，KPL，Gaithersburg)37 ℃孵育1 h，0.1%TBST 洗3次，每次15 min。

化学发光反应试剂盒(KPL，Gaithersburg)进行反应，显示目的蛋白质，暗
室曝光。

扫描X光片，用Pharmacia ImageMaster VDS软件分析目标带的吸光度值。

6 逆转录－聚合酶链反应(RT－PCR)定量检测TLR4 mRNA的表达
采用Bio－Tek离心柱型高纯总RNA快速提取试剂盒进行组织总RNA的提取。

紫外分光光度仪测定RNA样品纯度和含量。

逆转录反应体系总体积40 μL:含总RNA 7.8 μg、Oligo(dT)18primer 2 μL加 DEPC 水至24 μL、5 × reaction buffer 8 μL、Ribo-LockTMRNase inhibitor(2 ×107U/L)2 μL、10 mmol/L dNTP Mix 4 μL、RevertAid M － MuLV 逆转录酶(2×108U/L)2 μL，42 ℃孵育60 min，70 ℃终止反应5 min，cDNA产物－20℃保存备用。

PCR扩增，以cDNA为模板，在PCR扩增仪上进行，PCR总反应体积50 μL:RT 产物(cDNA)2 μL、下游引物1 μL、上游引物1 μL、2 ×Power Tag PCR MasterMix 25 μL，加ddH2O补足至50 μL。

按下述反应条件进行聚合酶链反应:94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃45 s，35个循环;72℃ 7 min。

目的基因TLR4及内对照β－actin引物序列见表1。

取10 μL PCR扩增产物加样，以500 bp的DNA marker 作标记于2%琼脂糖中电泳90 min(电压100 V)，溴乙啶染色，紫外分析仪下检测扩增产物，照片后用Pharmacia ImageMaster VDS软件分析目标带的吸光度值。

表1 RT－PCR引物序列Table 1.Sequences of primers for RT－PCRGene Primer sequence Product(bp)TLR4 Forward:5＇－
TGAGCAGTCGTGCTGGTATC －3＇ 170 Reverse:5＇－CAGCAGGGCTTTTCTGAGTC －3＇β －Actin Forward:5＇－CCATCGTCCACCGCAAAT－3＇ 196 Reverse:5＇－AACCGACTGCTGTCACCTTCAC －3＇
7 统计学处理
数据以均数±标准差(±s)表示，用SPSS 10.0统计软件包，行方差齐性检验、单因素方差分析及样本均数间的两两比较(q检验)，以α=0.05为检验水准。

结果
1 后适应对脑缺血海马神经元形态学改变的影响
随缺血时间的延长，海马损伤进行性加重，后适应后各时点损伤均明显减轻。

假手术组海马结构完整，层次清晰，海马神经元形态结构未见异常，CA1区椎体细胞形态正常，细胞核大而园，核仁明显，见图1。

缺血4 h时海马可见数个神经元嗜酸性变，后适应4 h组可见神经元嗜酸性变减少;缺血24 h时可见大量神经元嗜酸性变、核固缩，结构紊乱，见图2，后适应24 h组海马神经元损害明显减轻，见图3;缺血72 h时可见神经元减少，细胞层次减少，后适应72 h组神经元嗜酸性变减少，细胞层次增加。

Figure 1.Histological structure of hippocampus in tree shrews from sham －operation group(HE staining，×400).图1 假手术组海马组织结构
Figure 2.Histological changes of hippocampus 24 h after cerebral ischemia in tree shrews in I24h group(HE staining，×400).图2 缺血24 h海马组织学改变
Figure 3.Histological changes of hippocampus 24 h after cerebral ischemia in tree shrews in IP24h group(HE staining，×400).图3 缺血后适应24 h海马组织学改变
2 树鼩血栓性脑缺血及缺血后适应不同时点海马TLR4蛋白的表达
血栓性脑缺血后4 h和24 h海马TLR4蛋白表达较对照组明显增强(P＜0.05)，72 h与假手术组相比表达减弱(P＜0.05)。

随缺血时间的延长(4 h、24 h、72 h)，缺
血组TLR4的表达呈逐渐减少趋势，72 h时最低。

后适应处理组与假手术组对比，4 h TLR4表达有所增多，但无显著差异(P＞0.05)，24 h TLR4表达显著减少(P＜0.05)，72 h TLR4表达增多(P＜0.05)。

后适应组与缺血组对比，经后适应处理后
4 h和24 h海马TLR4表达显著减少(P＜0.05)，但72 h海马TLR4表达增加(P＜0.05)，见图4、5。

Figure 4.Representative Western blotting image of TLR4 in ischemic hippocampus of tree shrews at different time points.Sham:sham －operation group;I4 h，I24 h and I72 h:ischemia 4 h，24 h and 72 h groups，respectively;IP4 h，IP24 h and IP72 h:ischemic postconditioning 4 h，24 h and 72 h groups，respectively.图4 树鼩血栓性脑缺血及缺血后适应不同时点海马TLR4免疫印迹
Figure 5.The TLR4 protein expression in hippocampus of tree shrews at different time points after cerebral ischemia.±s.n=6.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs the cerebral ischemia group.图5 树鼩血栓性脑缺血及缺血后适应不同
时点海马TLR4蛋白表达
3 缺血后适应对脑缺血不同时点海马TLR
4 mRNA表达的影响
结果显示:与对照组相比，血栓性脑缺血后4 h、24 h及72 h海马TLR4 mRNA
表达明显增强(P＜0.05)。

随缺血时间的延长(4 h、24 h、72 h)，缺血组TLR4 mRNA表达进行性降低(4 h、24 h)，72 h最低。

后适应处理组与正常组对比，4 h TLR4 mRNA表达显著降低(P＜0.05)，24 h和72 h TLR4 mRNA 表达增加(P
＜0.05)。

后适应组与缺血组对比，经后适应处理后在4 h和24 h时点，TLR4
mRNA表达较脑缺血组明显减少(P＜0.05)，然而72 h时点TLR4 mRNA表达较
脑缺血组明显增多(P＜0.05)。

后适应组TLR4 mRNA表达总的趋势是逐渐递增的，见图6、7。

RT－PCR分析显示海马TLR4 mRNA的表达规律与Western blotting分析所示海马TLR4蛋白的表达规律基本一致。

Figure 6.RT－PCR analysis of mRNA expression of TLR4 and β－actin in hippocampus of tree shrews after cerebral ischemia and ischemic ne 1，2:sham － operation group;Lane 3，4:ischemia 4
h group;Lane 5，6:ischemic postconditioning 4 h group;Lane 7，8:ischemia
24 h group;Lane 9:marker of DL500;Lane 10，11:ischemic postconditioning 24 h group;Lane 12，13:ischemia 72 h group;Lane 14，15:ischemic postconditioning 72 h group.图6 树鼩血栓性脑缺血及缺血后适应不同时点海
马TLR4 mRNA表达
Figure 7.The TLR4 mRNA expression in ischemic hippocampus of tree shrews at different time points after cereb ral ischemia.±s.n=6.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs the cerebral ischemia group.图7 树鼩血栓性脑缺血及缺血
后适应不同时点海马TLR4mRNA表达
讨论
上世纪80年代有学者发现果蝇背腹部体轴分化发育所必需的一种跨膜蛋白，称之为Toll样受体。

1997年，首次证实人Toll样受体与果蝇同源。

TLR广泛分布于
中枢神经系统，在应对感染、缺血、创伤等损伤方面发挥重要作用，而TLR则是
固有免疫的核心作用因子［2］。

TLR4是Toll样受体家族研究颇多且极具代表性
的一个。

神经元已被证实可表达TLR4［5］。

受损组织和坏死细胞以及血管和细
胞间质损伤后可释放TLR4的内源性激活物，由TLR4触发级联免疫炎症反应，TLR4极可能是脑内免疫炎症反应链条上的上游核心作用因子［6］。

缺血后适应
的发现提示，机体缺血状态下，内部天然内源性保护机制的激活对机体抗损伤反应具有特殊的生物学意义。

缺血后适应可能有赖于TLR及其信号转导通路的调节变
化来抑制缺血所致免疫炎症反应。

缺血后适应可调节机体异常的免疫炎症反应，激活机体内源性调节保护机制，避免更严重的细胞损伤［7］。

新近研究发现后适应可产生某种抗炎症反应效应［8］。

本研究发现血栓性脑缺血组海马TLR4表达明显增加，提示脑缺血时TLR4作为炎性损伤因子与缺血后脑损伤相关，与既往报道［9］一致。

脑缺血后4 h及24 h
海马TLR4蛋白和 mRNA的表达增强，可能与严重脑缺血所致细胞应激，蛋白合
成加速有关。

研究发现TLR4是神经元死亡的主要原因，TLR4活化小胶质细胞及TLR4信号启动炎症毒性反应与此有关［10］。

随缺血时间的延长，缺血组TLR4
的表达呈逐渐减少趋势，缺血72 h时TLR4蛋白和 mRNA的表达恢复至对照水平，与我室既往观察其它指标的变化趋势一致，可能与脑缺血后期脑组织的抗损伤反应有关，对受损细胞的修复可能具有积极意义。

后适应处理后4 h和24 h TLR4蛋白表达减少，而后适应72 h TLR4蛋白表达增加。

海马TLR4 mRNA的表达趋
势与蛋白表达基本一致。

同时伴随的是后适应各时点海马神经元损伤明显减轻。

后适应产生的神经元保护作用与我室的前期研究相吻合。

我们的前期研究发现缺血后适应有较好的脑保护作用，表现为增加局部脑血流［4］，缩小皮层梗塞面积以及抑制海马CA1区神经元的凋亡(另文)。

后适应可使4、24 h时点TLR4蛋白及mRNA表达减弱，提示TLR4在脑缺血中的作用可能具有损伤效应。

然而后适应致72h TLR4蛋白及mRNA表达显著增强的机制值得进一步探索。

同时，我们也观察到在后适应各时点TLR4蛋白及mRNA表达是呈逐渐增高的趋势，这也提示TLR4在脑缺血后适应中的作用是一个动态连续的过程。

TLR4可促进脑
组织再生修复［11］。

Marsh等［12］研究认为预适应可“再编辑”TLR信号通路，最终达到某种炎症因子和抗炎因子之间的平衡，起到脑保护作用，这种内源性
的调控机制是机体有效的自我保护措施。

我们推测后适应是否亦有类似作用，后适应的脑保护作用在脑缺血损伤急性期(＜72 h)可能与抑制TLR4的表达有关，但在脑缺血损伤中后期(≥72 h)可能与TLR4表达增加有关。

Buchanan等［13］亦认为TLR4既可以起保护作用又可以是损伤性因子，这取决于不同的神经生理条件。

海马TLR4蛋白和mRNA的表达均在缺血4 h达高峰，其TLR4的动态变化在时间进程上较皮层的24 h要早(待发表)，显然与海马特殊的结构与功能有关。

综上所述，TLR4可能在缺血后适应介导的脑保护机制中发挥作用，今后尚有待更多更全面深入的研究予以证实，同时早日将缺血后适应运用到临床缺血性脑卒中的防治中去。

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