微生物实验室的分类及要求

五、微生物实验室的建筑要求
1.实验室的建设应以“无回路”为宗旨。 2.在时间和空间上可有效隔离各种检测活动。 3.实验室的区域设置上应至少包括以下部分： a.样品的接收和储藏区； b.样品的前处理区； c.样品的微生物检测区； d.培养区（BSL－2 实验室可与检测区合并）； e.标准菌株存放区（冰箱、低温冰柜或常温保存 箱）； f.培养基与器材准备区（也可与灭菌区合并）； g.无菌区；
5.实验室门应带锁并可自动关闭。实验室的门应有可视窗。 6.实验室应有足够的存储空间摆放物品以方便使用。在实 验室工作区域外还应有供长期使用的存储空间。 7.实验室内应使用专门的工作服，应戴乳胶手套。 8.实验室工作区域外应有存入个人衣物的条件。 9.实验室应配备高压蒸汽灭菌器，并按期检查和验证，以 保证符合要求。 10.应在实验室内配备生物安全柜。 11.应设洗眼设施，必要时应有应急喷淋装置。 12.应通风，如使用窗户自然通风，应有防虫纱窗。 13.有可靠的电力供应和应急照明，必要时，重要设备如培 养箱、生物安全柜、冰箱等应有备用电源。 14.实验室出口应有在黑暗中可明确辨认的标识。
二、生物危害评估
生物危害评估的内容： 危害程度评估应至少包括下列内容： A.生物因子的种类（已知的、未知的、基因 修饰的或未知传染性的生物材料）、 B.来源 C.传染性 D.致病性 E.传播途径 F.在环境中的稳定性 E.感染剂量 F.浓度 G.动物实验数据 H.预防和治疗。
【实验步骤】 1. 在0.2 mL Eppendorff管内配置50 μL反应体系：
反应物 体积（μL）
dd H2O
PCR缓冲液 （10×） MgCl2 （25 mmol/L）
35.5
5 4
dNTP （10 mmol/L ）
引物1 引物2 Taq DNA聚合酶
2.5
0.5 0.5 1
模板DNA
CRYSTAL生化鉴定结果
3.PCR扩增技术
PCR（polymerase chain reaction) ：聚合酶链 式反应，又称体外DNA扩增技术。是近年来发展 起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。 1985年由美国 Cetus 公司的Kary Mullis 首创的 PCR技术，可以将微量DNA片段扩增一百万倍以 上。 PCR技术的优点：敏感度高、特异性强、产率高、 重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、 考古学、法医学及体育等领域，并已普及到许多普 通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而 比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。
二、PCR的原理：
5‘ 3‘ 3‘ 5‘ 94℃变性5MIN 5‘ 3‘ 3‘ 55℃退火 5‘
5‘
5‘
3‘
3‘
3‘
72℃引物延伸 3‘ 模板变性
5‘ 5‘
5‘
3‘ 3‘ 5‘
3‘ 退火
5‘
5‘
3‘
3‘ 延伸
5‘3‘ 第二次循环
5‘
Step1. 变性：加热使模板DNA在高温下（94℃） 变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性 阶段。 Step2. 退火：溶液温度降至50～60℃，模板DNA 与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。 Step3. 延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA 聚合酶以单链为模板，利用引物的3’-OH，以反应 混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物， 按5’－3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
敏感度高特异性强产率高重复性好以及快速简便等广泛应用于微生物学重复性好以及快速简便等广泛应用于微生物学考古学法医学及体育等领域并已普及到许多普考古学法医学及体育等领域并已普及到许多普通实验室大大简化了传统的分子克隆技术从而通实验室大大简化了传统的分子克隆技术从而比较容易地对目的基因进行分析鉴定
微生物实验室的分类及要求
PCR实验的缺点： 1.模板DNA的制备较难。由于食品中成分复杂，油脂 及金属离子等会抵制TQP酶的活性，如用煮沸裂解 法直接提取DNA，则很难去除油脂等杂质。 2.假阴性结果：由于影响PCR的因素很多，扩增效果 常不理想。会出现较多的假阴性现象，影响到结果 的准确性。 3.检测效果：由于PCR不能区分死菌与活菌，故在定 量分析效果不佳。 4.检测限：PCR检测技术要求有较低的检测限，国际 标准规定检测为每25g一个微生物细胞，而PCR的 样品取用量很少，必须进行增菌培养后才能进行常 规定量。
h.污染物处理区； i.办公区； j.更衣室； 4.建筑要求： a.墙壁、天花板、地面和桌椅、操作台应光滑易清 洁。 b.天花板应设置为统一无隙整体，以减少灰尘下落 c.地面、墙壁、天花板连接处应有弧度。 d.除非密闭包装，液体运输管路不应在工作区上方 穿过。 e.换气系统中应有空气过滤装置。
微生物检测的新技术
一、微生物的生物安全等级
根据生物因子对个体和群体的危害程度可将微生物 分为4 级 1.危害等级I （低个体危害，低群体危害） 这类微生物包括：不会导致健康工作者和动物致病 的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子。 2.危害等级 Ⅱ (中等个体危害，有限群体危害) 这类微生物能引起人或动物发病，但一般情况下对 健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危害 的病原体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效 治膜法—以纸片法为代表
纸片法是目前被广泛接受的方法。国标餐具大肠菌 群采用的就是纸片法。 优点：无需制备培养基，携带方便，非漫延菌落计 数较方便。 缺点：检测成本相对偏高。与传统标准缺乏对应规 律，不能替代传统检测方法，重现性较差。
2.微生物生化自动鉴定仪
代表厂商：BD crystal,梅里埃 VITEK系统，英国 AUTOREAD细菌鉴定系统。 鉴定原理：在细菌鉴定板中加 入指示剂记录细菌生长后发生 的颜色变化，利用统计软件计 算生化反应的概率。得出生化 反应的结果。 优点：可以完全替代传统生化 反应，可一次检出多种致病微 生物，灵敏度高。 缺点：仍然需要进行传统增菌 培养，成本较高。
1
2. 按下述程序进行PCR扩增: 1） 94℃ 预变性 3 min； 2） 94℃ 变性 1 min； 3） 55℃ 退火 45 sec； 4） 72℃ 延伸 1 min； 5） 重复步骤2~4, 34次； 6） 72℃ 延伸 10 min； 7） End. 3. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果 配制1％琼脂糖凝胶，取10 μL扩增产物电泳。保持 电压100V。电泳结束后，在紫外灯下观察结果。
三、微生物致病能力的影响因素
决定微生物致病能力的因素主要有以下几个方面： A.菌量； B.菌龄； C.感染途径； D.被感染者； E.存留时间；
四、BSL-2级实验室的相关要求
一、选址布局： 实验室布局应分清洁区、半污染区和污染区，人流、 物流、信息流应有效分隔 。 二、设施和设备要求： 1.实验室应有防止节肢动物和啮齿动物进入的设计 和设施。 2.实验室的墙壁、天花板和地面应平整、不渗水、 易清洁并耐化学品和消毒剂的腐蚀。地面应防滑， 不得铺设地毯。 3.实验台面能防水、耐腐蚀、耐热。实验台和橱柜 应牢固稳定，彼此之间保持一定距离，以便于清洁。 4. 实验室内照明应保证工作需要，避免反光和强光。
3.危害等级 III （高个体危害，低群体危害） 这类微生物能引起人类或动物严重疾病，或造成严 重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传 播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗的病原体。 4.危害等级 Ⅳ (高个体危害，高群体危害) 能引起人类或动物非常严重的疾病，一般不能治愈， 容易直接或间接或因 偶然接触在人与人，或动物与人，或人与动物，或 动物与动物间传播的病原体。