PRRSV Nsp2高变区基因的表达及免疫学特性鉴定

PRRSV Nsp2高变区基因的表达及免疫学特性鉴定
马利宏;肖一红;吕军华;王伟伟;董施伟;周恩民
【摘要】本研究分别扩增从"高热病"猪体内分离株(TA-12)及美洲经典株ATTC-VR2332 PRRSV Nsp2基因的高变区,亚克隆至表达载体pET-28a中,转化至E.coli BL21中,在IPTG的诱导下进行表达.用SDS-PAGE、Western-blot对表达产物进行鉴定.表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,对其免疫原性进行研究.建立了以纯化的重组蛋白作为包被抗原的间接ELISA,确定了临界值,用建立的ELISA方法并对400份猪血清进行了检测和应用.结果表明,成功的表达了分离株TA-12及ATTC-
VR2332 Nsp2基因的高变区.表达蛋白纯化分别免疫小鼠后,获得多克隆抗体,其抗体效价均为1∶100000.优化的ELISA条件为:包被缓冲液为磷酸盐缓冲液,800 ng/孔,血清样品稀释浓度为1∶100.临界值为0.4.血清检测结果表明以两种蛋白为包被抗原均为阳性的血清最多,占到总数的58.5%,前者阳性后者阴性的血清阳性率28%,前者阴性后者阳性的血清阳性率8.75%,二者均为阴性的占到4.75%.为建立区别两种毒株的鉴别诊断间接ELISA试剂盒奠定基础.%Hypervariable region in Nsp2 gene of isolate ( TA-12 ) and ATTC-VR2332 were cloned and subcloned into pET-2aa prokaryotic expression system to get recombinant protein after induction of IPTC. The recombinant proteins were identified by SDS-PACE and Westemblot. BALB/c mice were immunized to analyze their immunogenicity. An indirect ELISA was developed coating with recombinant protein. 400 sera were detected by the developed ELISA. The results showed hypervariable region in Nsp2 gene of isolate and ATTC-
VR2332 were over expressed in pET-28a vector. High antibody levels were both acquired after immunized with purified products. The optimized
conditions for ELISA were phosphates balanced solution as coating buffer , 800 ng/well with purified products , sample area diluted as 1 ∶ 100 , the cutoff value is 0. 4. The positive sera occupied 58. 8 ％ detecting with both recombinant protein. Sera positive with recombinant protein from iaolate and negative form ATTC-VR2332 was 28 ％ . Sera negative with recombinant protein from isolate and positive fonn ATTC-VR2332 was 8 . 75 ％ , both negative was 4. 75 ％ . Two recombinant proteins could discriminate difierent sera. It provide the important foundation for development of an ELISA to discriminate two type virus in serology level.【期刊名称】《西南农业学报》
【年(卷),期】2011(024)001
【总页数】5页(P305-309)
【关键词】PRRSV;Nsp2;表达;免疫学;ELISA
【作者】马利宏;肖一红;吕军华;王伟伟;董施伟;周恩民
【作者单位】山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业大学动物科技学院,山东,泰
安,271018;山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271018
【正文语种】中文
【中图分类】S829.1
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的一种急性传染病,以繁殖障碍、呼吸系统疾病等为主要特征,主要引起母猪流产,产死胎、弱仔等临床症状。

PRRSV于1996年在我国首次报道[1],在这短短的十几年里,PRRSV几乎流行于全国各个猪场。

特别是在 2006～2007年间,突变的PRRSV引起在我国南方一些省份猪场暴发“高热”综合征[2ˋ6],使我国的养猪业遭到了巨大的影响,以至于猪肉价格居高不下,严重影响着人们的生活水平。

PRRSV病毒粒子呈球形、有囊膜,其基因组为单股、正链、不分节段RNA,长约15.4 kb,含有9个相互重叠的开放读码框,其中ORFla和ORFlb编码病毒的RNA 复制酶和聚合酶,占基因组全长的 80 %。

非结构蛋白Nsp2位于ORFla内,长约
3Kb,是PRRSV基因组中变异性最高的一个基因,也是病毒分类的依据[7]。

Nsp2
中间区可以允许其中的部分氨基酸的缺失,具有很高的变异性,它在不同的分离株中常有氨基酸缺失,是造成毒株长度不同的主要原因[8ˋ10]。

目前已经明确,在 2006年暴发的“高热病”中起重要作用的PRRSV的Nsp2上有不连续的30个氨基酸的缺失,很多学者将其称之为“高致病性PRRSV”。

现有的疫苗对高致病性PRRSV的预防效果不理想,目前已有针对其预防的新型疫苗,高致病性PRRSV的诊断显得尤为重要。

目前对于高致病性PRRSV的诊断还仅限于核苷酸水平即对缺失序列的鉴定,这种方法准确,但是费时,成本高。

本研究采集临床上高热病病猪的组织器官,从中分离高致病性PRRSV并进行鉴定。

克隆分离株及美洲标准株VR-2332 Nsp2高变区基因,进行原核表达,对其免疫生物学特性进行鉴定,建立了间接ELISA方法并进行了初步应用。

为建立一种血清学水平鉴别诊断的ELISA试剂盒奠定基础。

1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 病毒 PRRSV山东高变异株TA-12、美洲标准株ATTC-VR2332,由山东农业
大学免疫生物学实验室保存。

1.1.2 试剂 TRIzol购自sigma公司,高保真DNA聚合酶PrimeSTARHSDNA Polymerase,限制性内切酶EcoRI,XhoI,DNA片段纯化试剂盒,质粒DNA小量纯化试剂盒均购自大连宝生物公司。

1.1.3 载体与菌株载体pMD18-T购自大连宝生物公司。

pET-28a、菌株DH
5a,E.coli BL21(DE3) plys购自sigma公司。

1.1.4 引物设计比对GenBank上发表的ATTCVR2332序列和国内突变株序列,利用PrimerSelect5.0软件设计引物。

引物由上海生物工程公司合成。

RT:5'-CAATGCCAAGCCTAAG CA-3',Nsp2-VF:5'-CGGAATTCGACACCTCCTTTGATTGG-3', Nsp2-V-R:5'-GAAGCTCGAGTTAAGT CAG CATGTCAACCC-3'划线部分分别引入EcoR I,和Xho I位点。

1.1.5 PRRSV阳性血清 400血清由本实验室保存,其中来自未免疫PRRSV疫苗的
有254份,灭活苗的有 58份,弱毒苗47份,免疫背景不清楚的有41份。

1.2 实验方法
1.2.1 重组质粒的构建按TRIzol使用说明书从TA-12株和ATTC-VR2332株的Marc-145细胞培养物中提取病毒总RNA。

反转录体系参照AMV酶使用说明书。

以RT为反转录引物,以Nsp2-V-F, Nsp2-5-R为上下游引物,进行RT-PCR扩
增,PCR产物按DNA片段纯化试剂盒使用说明回收目的片段,将胶回收的目的基因
和原核表达载体pET-28a用EcoRI/XhoI双酶切,分别回收目的片段,用T4 DNA连接酶16℃连接过夜,转化 DH5a菌种感受态细胞,涂布Kan+琼脂板,挑单菌落摇菌,
小量提取质粒DNA,选择双酶切、质粒PCR鉴定均为阳性的质粒送上海生物工程
公司测序,阳性质粒分别命名为pET-Nsp2-V-12,pET-Nsp2-V-VR。

1.2.2 诱导表达选择PCR方法和测序鉴定正确的重组表达质粒,转化到
E.coliBL21(DE3)中,涂布于 Kan+的固体琼脂培养基,挑取单克隆菌接种于5 m L LB 中,37℃荡培养。

当光密度吸收值(OD)达到0.6时,加入IPTG(1000 mmol·L-1)至终浓1mmol·L-1,37℃,225 r/min振荡培养6 h,收菌。

1.2.3 表达抗原的SDS-PAGE和Western-Blotting鉴定制备12%凝胶一块,电泳完毕,20 V转印25 min,含2.5%脱脂奶粉的PBS′T4℃封闭过夜,一抗使用PRRSV 阳性血1∶100稀释室温孵育1h,二抗使用羊抗猪酶标辣根过氧化物酶1∶2000稀释,加底物显色5 min。

1.2.4 表达抗原纯化表达菌离心收集菌体,超声波处理后,取蛋白进行SDS-PAGE分离,用KCl负染,切下白色的目的条带,将切下的条带放于电洗脱仪上进行纯化。

使用Bradford蛋白质定量试剂盒测定纯化的重组蛋白浓度。

1.2.5 免疫原性鉴定将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,100mg/只腹腔免疫3次,2次免疫相隔 2周,初次免疫用弗氏完全佐剂,其余 2次用弗氏不完全佐剂,每次免疫前采集血清,检测抗体水平。

1.2.6 间接ELISA反应条件的优化用方阵滴定方法分别确定包被缓冲液、封闭液、表达抗原包被浓度、血清稀释倍数、辣根过氧化酶标记羊抗猪IgG浓度,利用实验室保存的用IDEXX试剂盒检测为阴性的 50份血清确定其临界值。

1.2.7 建立的ELISA方法的初步应用利用建立的ELISA方法对本实验室中保存的400份血清进行检测。

2 结果与分析
2.1 重组质粒的构建
图1 重组质粒鉴定结果Fig.1 Results of recombinant plasmid
利用RT-PCR方法从TA-12和ATTC-VR2332的Marc-145细胞培养物中扩增目
的基因片段,1%琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物,获得了与预期片段大小相符的单一扩增条带(图4)。

通过对重组质粒进行双酶切鉴定和质粒PCR鉴定得到了阳性质粒,分别命名为pET-Nsp2-V-12,pET-Nsp2-V-VR(图1)。

序列测序结果表明克隆至原核表达载体中的外源基因片段没有发生突变,插入方向和位置与预期结果一致。

2.2 重组蛋白的表达和鉴定
收获的细菌裂解后,经SDS-PAGE电泳,结果得到了山东突变株Nsp2目的蛋白约42kD美洲标准株Nsp2目的蛋白约45.3 kD(图2),Western blot鉴定结果在目的蛋白分子量处得到了特异性条带(图3),证明所表达白具反应原性。

图2 重组Nsp 2高变区蛋白的SDA-PAGE结果Fig.2 Expression analysis of hypervariable region of Nsp2 by SDSPAGE
图3 W estern-blot结果Fig.3 AnalysisofWestern-blot
2.3 重组蛋白的纯化
电洗脱纯化重组蛋白电泳得到单一的目的条带,获得纯度较高的重组蛋白,见图4。

2.4 免疫原性鉴定
将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,血清有效检测浓度为1∶1000000,证明免疫原重组蛋白具有较好免疫原性。

2.5 间接ELISA反应条件优化及临界值确定结果
包被液为磷酸盐缓冲液,抗原最佳包被浓度800 ng/孔,封闭液10%FBS,样品最佳稀释浓度为1∶100,酶标二抗的最佳使用浓度为1∶4000。

用已经建立的间接ELISA 方法对实验室保存的50份阴性血清检测,确定样本临界值为0.4。

2.6 建立的ELISA方法的初步应用结果
利用优化的ELISA条件,以pET-Nsp2-V-12和pET-Nsp2-V-VR为包被抗原,对本实验室保存的400份猪血清进行检测,OD450≥0.4判定为阳性, OD450＜0.4判为阴性。

不同背景的血清检测结果不一致,pET-Nsp2-V-12和pET-Nsp2-V-VR均为
阳性的血清最多,占到总数的 58.5%,前者阳性后者阴性的血清阳性率 28%,前者阴
性后者阳性的血清阳性率8.75%,二者均为阴性的占到4.75%。

详见表1。

图4 蛋白纯化结果Fig.4 Analysis of purification
表1 包被PRRSV Nsp2重组蛋白为抗原的间接ELISA检测猪血清结果Table 1 The result of swine serum antibodiesagainst PRRSV Nsp2 by I-ELISA
注:A:pET-Nsp2-V-12,B:pET-Nsp2-V-VR,“+”阳性,“-”阴性。

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3 讨论
PRRS不仅是危害我国养猪业的头号“杀手”,而且也是世界养猪业的最大的威胁,
也美国下一个要扑灭重要猪病。

该病在许多猪场表现为隐性感染和持续感染,一旦
猪体免疫功能下降,就可重新暴发。

我国自从 2006年暴发的“高热症”以来,该病
的发生一直不断,2009年又有部分猪场因其而遭到破产打击。

其病原是以PPRSV
为首的多病原混合感染,PRRSV主要特点是在Nsp2上有不连续的30个氨基酸的
缺失,并且所有的分离株其核苷酸缺失的位置和数量均保守,这也是很多学者把它作
为高致病性PRRSV特征之一的原因,尽管现有的研究报道此缺失与PRRSV的致病性关系不密切[11]。

本研究利用从 2007年 9月份开始收集的 15份临床上有高热或者是剖检肺有间质性肺炎病变的猪的肺。

根据PRRSV的基因序列的保守部位设计了扩增ORF7序列的引物。

ORF7是所有类型PRRSV中最保守的一段序列。

共检测出 6个阳性样品,这6个样品均成功的分离到高致病性PRRSV。

并用序列测定、IFA、电镜观察对
其进一步的鉴定。

测序结果表明所分离的毒株其Nsp2上均有缺失,缺失的数量和
位置均与报道的一直[3～6]。

为了对Nsp2基因进一了解,克隆高致病性和经典PRRSV的高变区,进行原核表达。

表达的产物纯化后对其免疫学特性进行研究。

将其免疫小鼠后,三免后两种蛋白在1∶10 000稀释时其OD值仍能达到 0.6以上,说明有很好的免疫原性,表达产物还
能与猪PRRSV阳性血清反应,说明具有较好的反应原性。

在此基础上将表达产物包被ELISA板,建立一种能区分高致病性和经典PRRSV的ELISA方法。

经条件优化后,利用本实验室保持的阴性血清对其临界值进行确定,最终确定其临界值为 0.4。

利用建立的ELISA方法对实验室的400份血清进行了检测,检测结果显示,以pET-Nsp2-V-12和pET-Nsp2-V-VR为包被抗原,均为阳性血清数为234份,占血清总数的 58.5%。

前者阳性后者阴性的血清数为 112,占血清总数的 28%。

前者阴性后者阳性的血清数为35,占血清总数的 8.75%。

用DNAStar软件分析所表达区域的氨基酸序列,二者的同源性为72.4%。

以两种蛋白为包被抗原均为的血清数能占到58.5%,说明二者有相同的抗原表位。

以两种蛋白为包被抗原阴阳性血清数量有差别,说明二者又有着不同的抗原表位,这就为变异株和传统株鉴别诊断ELISA方法奠定基础。

结果还发现在 58份灭活苗免疫的猪中两种蛋白检测均为阳性的能占到67.2%,前者阳性后者阴性的占到19%,前者阴性后者阳性的占到 1.7%,说明有突变株和经典株感染的几率为87.9%,说明灭活苗对现流行的PRRSV突变株的预防效果不理想。

47份弱毒苗免疫的猪中两种蛋白检测均为阳性的能占到57.4%,前者阳性后者阴性的占到 8.5%,说明现有的弱毒疫苗对PRRSV突变株的预防效果不理想,从整体看来未免疫猪群要比免疫猪群感染的几率要高。

抗体水平的差异可能不是单一因素引起的,而是各种综合因素导致的结果。

究竟那些抗原表位变异导PRRSV抗体水平的差异,还有待于进一步的研究。

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