【推荐文档】第三节冷冻蚀刻样品制备技术PPT

HUS---5GB真空喷镀仪
（4）、喷发点的调整：将两组电极安装好后，必须 用三点一线的方法再细心校正，使喷发点分别对准 两隔热板孔和喷碳与喷铂孔道的正中央。否则铂和 碳可能喷不到样品的表面上。最后将碳棒可动侧的 弹簧调节好，使得弹力大小要适当。如果太松加热 后可能短路，碳棒尖端会离开斜面；太紧对应面碳 棒的尖端会滑落而不能进行喷镀 。校准完毕将割 断装置移出喷镀仪的钟罩。（5）、烧制铂珠：为 了提高喷镀效果，要在喷镀前将碳棒上缠绕的铂丝 在低真空（10－2～10－3讬）状态下溶化呈珠状。铂 珠在碳棒磨细端的尖端，并将铂珠对准孔道，控制 好真空度和加热电流是铂珠烧制的关键。
磨细的一端的中间区。铂丝在碳棒上一定缠 9、复型膜的分离与清洗：喷镀结束后，把真空罩内恢复大气压，取出样品杯放入盛有蒸馏水的白色坩埚内，用针尖轻轻将杯中的样品
挑于水中。 9、复型膜的分离与清洗：喷镀结束后，把真空罩内恢复大气压，取出样品杯放入盛有蒸馏水的白色坩埚内，用针尖轻轻将杯中的样品
挑碳于棒水 的中安。装绕及其紧铂珠的密烧结示，意图否则会在碳棒上烧成散在的小铂珠 （见下图）。 碳电极的喷发点与样品表面呈900角，铂电极的喷发点与样品表面呈450角，两个电极喷发点离样品表面为10～11cm。
磨成直径为1mm，长度约为5mm。（2）、缠绕 20%、30%的甘油-生理盐水（～）；
碳棒的安装 及其铂珠的烧结示意图
铂丝：取直径的铂丝8～12cm，缠绕到D碳棒 最后取出经喷镀的样品，把有机组织腐蚀掉，将复型膜捞在铜网上，用透射电镜观察。
5、安装割断刀和加热器：将专用的刀片安装到刀座上，刀刃要凹进滑面，拧紧螺丝。 铂珠在碳棒磨细端的尖端，并将铂珠对准孔道，控制好真空度和加热电流是铂珠烧制的关键。
最后将碳棒可动侧的弹簧调节好，使得弹力大小要适当。 最后将碳棒可动侧的弹簧调节好，使得弹力大小要适当。
一端磨成15度的斜角，C、D两段碳棒的一头 1、样品的取材、固定和防冻处理 ：将实验动物迅速杀死，在1分钟之内取出肝脏等组织，迅速放入预冷的％的戊二醛内，稍固定一段
时间后，在蜡板上滴加少量冷固定液，将组织切成细条状，其大小为，再放入％的戊二醛中固定15～20分钟，组织变硬后再对组织进 行修块，继续固定3～5小时。
第三节冷冻蚀刻样品制备技术课件
（优选）第三节冷冻蚀刻样品 制备技术课件
出割断面上各种细胞器的膜结构，这一过程称为 蚀刻。
然后以不同的角度在经过蚀刻的断面上喷上 一层铂和碳的投影膜，在断面上形成一层复型膜； 最后取出经喷镀的样品，把有机组织腐蚀掉，将 复型膜捞在铜网上，用透射电镜观察。在复型膜 上不仅能观察到细胞器的各种膜结构，而且还能 观察到细胞的连接装置，核膜孔、膜内颗粒等。 此外，图像的立体感强、分辨率高（可达），而 且复型膜可长期保存。但用该技术制作样品耗费 高，成功率较低，技术程序较复杂，一般不易掌
HFZ—1冷冻割断装置的组装示意图
3、冷冻蚀刻复型装置的准备：在样品处理
到冷冻开始之前，先将真空喷镀仪通电预抽
真空。为保证割断装置的良好性能，每次使
用之前必须认真进行擦拭，以除去水分、油 太紧对应面碳棒的尖端会滑落而不能进行喷镀 。
2、碳棒与铂珠的制备和组装 ：（1）、碳棒的预处理：取长约5～6cm，直径3mm的光谱纯碳棒4段（A、B、C、D），将A、B两段碳 棒的一端磨成15度的斜角，C、D两段碳棒的一头磨成直径为1mm，长度约为5mm。
握。
示核ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ孔
示高尔基复合体和线粒体
二、样品制作前的准备工作
1、仪器设备：冷冻蚀刻仪，封闭式 FD-2A型， 日立公司生产；开放式是用 真空喷镀仪（HUS-5GB型与冷却割断装置 HFZ-1日立产）配合组成。
2、试剂：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液 配制）、／L磷酸缓冲液～7.4)；20%、 30%的甘油-生理盐水（～）；腐蚀液 （次氯酸钠）、液氮、30％的丙酮水溶 液、蒸馏水、光谱纯碳棒和 丝或铂丝 等。
污和氧化层，必要时可用抛光膏和丙酮进行 然后用的磷酸缓冲液（～）清洗样品～1小时，之后将样品放入25％和30％的甘油——生理盐水混合液中各处理4～6小时。
然后再使碳电极通电，以900角向样品表面喷镀碳来加固复型膜。
2、碳棒与铂珠的制备和组装 ：（1）、碳棒
的预处理：取长约5～6cm，直径3mm的光谱纯 否则铂和碳可能喷不到样品的表面上。
然后用的磷酸缓冲液（～）清洗样品～1小时，之后将样品放入25％和30％的甘油——生理盐水混合液中各处理4～6小时。
碳棒4段（A、B、C、D），将A、B两段碳棒的 5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）、／L磷酸缓冲液～7.
FD---2A冷冻蚀刻仪 HFZ—1冷冻割断装置的组装示意图 20%、30%的甘油-生理盐水（～）；
碳棒的安装 及其铂珠的烧结示意图
（3）、碳棒的组装：先将HFZ－1型冷冻割断 装置装好（如图）放入HUS－5GB真空喷镀仪的 钟罩内的塑料底盘上，将“A”碳棒固定在钟罩 内的一个固定电极上，碳棒的150斜面对准割 断装置的一个孔道；“C”碳棒固定在对应的可 动电极上，使其细端顶在A碳棒斜面的中间， 这就是一对碳电极。然后，将“B”碳棒固定到 另一个固定电极上，使150的斜面对准另一个 孔道，“D”碳棒固定到“B”碳棒对应的活动电 极上，使其细端对在“B”碳棒斜面的中间，这 是铂电极。碳电极的喷发点与样品表面呈900 角，铂电极的喷发点与样品表面呈450角，两 个电极喷发点离样品表面为10～11cm。
HFZ—1冷冻割断装置的组装示意图
FD---2A冷冻蚀刻仪
三、样品制作步骤（以开放式冷冻蚀刻装置为例）
1、样品的取材、固定和防冻处理 ：将实验 动物迅速杀死，在1分钟之内取出肝脏等组织， 迅速放入预冷的％的戊二醛内，稍固定一段时 间后，在蜡板上滴加少量冷固定液，将组织切 成细条状，其大小为，再放入％的戊二醛中固 定15～20分钟，组织变硬后再对组织进行修块， 继续固定3～5小时。然后用的磷酸缓冲液（～） 清洗样品～1小时，之后将样品放入25％和30 ％的甘油——生理盐水混合液中各处理4～6小 时。