应用反相高效液相色谱法测定绵羊瘤胃液、肉鸡粪中吲哚和粪臭素含量

应用反相高效液相色谱法测定绵羊瘤胃液、肉鸡粪中吲哚和粪
臭素含量
吴婷婷;杨开伦;聂彪彪;祖玲玲;买买提·吾肉孜;努尔比亚木·萨吾提
【摘要】[ Objective ] A rapid reversed - phase high - performance liquid chromatography ( RP -HPLC) method for the quantitative determination of indole and skatole in ruminal fluid and broilers'faeces has been developed. [ Method ] Broiler diets were added antibiotics, gluconic acid and lactulose. Faeces were sampled during the period of 13 -15 days, 20 -22 days, 33 -35 days and 40-41 days of broilers, respectively. The ruminal fluid was sampled at 0, 1, 3, 6 and 9 hours after feeding. [Result]The HPLC column was eluted with a mobile phase consisting of acetonitrile; water at a flow rate of 1 mL/ min at 30°C. Fluorescence (excitation and emission at 270 nm and 350 nm, respectively) was used for selective detection. The method has characteristics of time - saving, higher resolution and sensitivity (indole 142. 8 ng/mL, 2. 142 ng/15 μL injection; skatole 1 ng/mL, 0.015 ng/15 μL injection). The concentration of indole in faeces during 34 - 36 d of broiler fed with gluconic acid and lactulose reached its maximum, while that of the group fed with antibiotic supplement presented an increasing trend with ageindays. The concentration of skatole in-creased in three groups in 40 -41 d, among which, the groups fed with antibiotic and lactulose supplement increased obviously, while the group fed with gluconic acid supplement increased the least. The concentration of indole in the ruminal fluid 1.5 h after feeding achieved the maximum in the sheep. The indole
content of the group fed with 800 g concentrate supplement was higher than that of the group fed with 400 g concentrate supplement and there was no significant difference among the two levels of concentrate supplement at other times; the content of skatole in the ruminal fluid 3 h after feeding reached the maximum. [ Conclusion ] The concentrations of indole and skatole in sheep ruminal fluid had similar tendency when feeding them with two levels of concentrate supplement. Concentrations of skatole in the ruminal fluid 1.5 - 9 h after feeding increased exclusively. Concentrations of indole and skatole in broilers'faeces were associated not only with diet but also with the age of broiler.%[目的]建立适于绵羊瘤胃液和肉鸡粪中痕量吲哚、粪臭素测定的反相高效液相色谱法.[方法]肉鸡日粮中分别添加饲用抗生素、葡萄糖酸和乳果糖,收集13～15、20～22、33～35和40 ～41日龄肉鸡的粪；采集绵羊饲喂前(记为0h),饲喂后1.5、3、6和9h的瘤胃内容物.[结果]色谱条件,流动相:乙腈:水,流速1mL/min,柱温30℃,激发波长270nm,发射波长350nm,梯度洗脱；方法具有分离时间短(10 min以内),样品处理简单、分离度好、灵敏度高(吲哚142.8 ng/mL,绝对量2.142 ng/15 μL;粪臭素1 ng/mL,绝对量
0.015ng/15 μL)的特点.葡萄糖酸组、乳果糖组肉鸡粪中吲哚含量在肉鸡34～36日龄时达到高峰值,抗生素组肉鸡粪中吲哚含量随日龄呈现上升趋势；从粪臭素含量来看,40 ～41日龄时肉鸡粪中含量有所增加,其中,饲用抗生素组、乳果糖组增加最明显,葡萄糖酸组增加最少.绵羊瘤胃液中吲哚含量在饲喂后1.5h达到最高值,饲喂800 g精料日粮时含量极显著高于饲喂400 g精料日粮,其余各时间点两种日粮之间差异不显著；而瘤胃液中粪臭素含量在饲喂后3h达到最高值,且饲喂800 g 精料日粮时含量都有高于饲喂400 g精料日粮时.[结论]肉鸡粪中的吲哚、粪臭素含量不仅与日粮有关,还与肉鸡的日龄有关.饲喂两种水平的精料补充料时绵羊瘤胃
液中吲哚、粪臭素含量的动态变化规律基本相似；高精料饲喂后1.5 ～9 h内,瘤胃液中的粪臭素含量普遍升高.
【期刊名称】《新疆农业科学》
【年(卷),期】2011(048)009
【总页数】7页(P1723-1729)
【关键词】:反相高效液相色谱;吲哚;粪臭素;瘤胃液;肉鸡粪
【作者】吴婷婷;杨开伦;聂彪彪;祖玲玲;买买提·吾肉孜;努尔比亚木·萨吾提
【作者单位】新疆肉乳用草食动物营养实验室,乌鲁木齐830052;新疆肉乳用草食动物营养实验室,乌鲁木齐830052;新疆肉乳用草食动物营养实验室,乌鲁木齐830052;新疆肉乳用草食动物营养实验室,乌鲁木齐830052;新疆肉乳用草食动物营养实验室,乌鲁木齐830052;新疆肉乳用草食动物营养实验室,乌鲁木齐830052【正文语种】中文
【中图分类】S852.21
【研究意义】来源于饲料蛋白或肠道脱落上皮细胞中的色氨酸，在猪禽回肠段后的消化肠道中经微生物的厌氧发酵，产生包括吲哚乙酸、吲哚及3-甲基吲哚(即粪臭素)等挥发性物质[1，2]。

许多研究表明，粪臭素是公猪肉有异味的主要物质之一[3]，粪中含有的吲哚基团化合物还是猪禽粪的重要臭味物质[4，5]；也是引起反刍动物感染急性肺水肿和肺气肿(ABPE)的主要物质。

因此，减少猪禽肠道中的吲哚类物质的合成，不仅能降低粪的臭味，有利于环境，而且也能显著降低猪肉中粪臭素的含量，提高肉品质。

【前人研究进展】有关猪粪、猪肉(背膘、肌肉)中粪臭素含量的研究已有较多报道[4～6]，也见有产蛋鸡粪中吲哚、粪臭素含量的研究
[7]。

【本研究切入点】有关肉仔鸡的粪中以及饲喂两种不同精料水平时绵羊瘤胃
液中吲哚类物质(特别是粪臭素含量)动态变化的研究报道较少。

【拟解决的关键问题】在前人相关研究的基础上，首先建立吲哚、粪臭素等重要吲哚类物质含量的测定方法，然后对饲喂两种水平的精料补充料时绵羊瘤胃液以及含有饲用抗生素及用葡萄糖酸、乳果糖替代饲用抗生素的肉仔鸡粪中吲哚、粪臭素的含量进行测定，为今后进一步开展通过日粮调控手段调节胃肠道中吲哚类物质含量的相关研究奠定方法学基础。

1.1 主要仪器及试剂
Shimadzu LC-6A高效液相色谱仪，包括：二元洗脱系统(LC-6A)、RF-535荧光
检测器、CTO-6A柱温箱、SCL-6A控制器N2000色谱数据工作站(浙江大学智达科技信息有限公司)。

色谱柱(ZORBAX Eclipse XDB-C8，4.6×150 mm，5μm，Agilent公司)。

葡萄糖酸(上海卡博工贸有限公司)，乳果糖(上海卡博工贸有限公司)，3-甲基吲哚(Sigma公司，纯度为99%)，吲哚(Sigma公司，纯度为98%)，甲醇(色谱纯，SK chemicals公司)，乙腈(色谱纯，SK chemicals公司)；二次蒸
馏水，自制。

1.2 材料
135只1日龄的白羽肉鸡仔随机分成3个处理组，每组设3个重复，每个重复15只，饲用抗生素组饲喂基础日粮添加那西肽300 mg/kg(有效成分为含量10%)和
硫酸粘杆菌素250 mg/kg(有效成分含量8%)，葡萄糖酸组、乳果糖组日粮为1
kg基础日粮基础上分别添加1 g葡萄糖酸和10 g乳果糖，进行为期42 d的饲养试验，饲喂不限食量，让其自由饮水。

基础日粮组成为玉米(61%)、豆粕(30%)、
鱼粉(2%)、麸皮(1.9%)、石粉(1.3%)、磷酸氢钙(1.5%)、食盐(0.3%)、豆油(1.0%)、预混料(1.0%)。

营养水平为代谢能ME(12.06 MJ/kg)、粗蛋白CP(20.25%)、钙
Ca(0.9%)、总磷TP(0.68%)。

选取3只装有永久性瘤胃瘘管的成年绵羊，按分期试验设计分为两期：第一期内
精料补充料(主要由玉米、棉籽粕组成)饲喂量为400 g/(d·羊)；第二期内精料补充料饲喂量为800 g/(d·羊)。

试验羊只单笼饲养，粗饲料(切碎小麦秸秆)自由采食，自由饮水。

精料补充料分早晚两次等量饲喂。

每期预试期11 d，正试期3 d。

1.3 样品的采集和处理
鸡粪：在肉鸡饲养期间，分别收集13～15、20～22、33～35和40～41日龄鸡
的粪。

每天08：00、20：00分别收集一次，以每个重复组为单位进行收集、分样；把样品混匀后取每个样品重的10%用样品袋收集，把每个重复组3 d采集的
鸡粪再各取20%混匀，-20℃冷冻保存，备用。

取1.00 g样品移入10 m L玻璃
试管中，加入3 m L甲醇，漩涡混匀；在40℃条件下水浴20 min，期间每隔5 min混匀一次；水浴结束后，样品置于在-21℃冰箱中静置15 min，以加快颗粒
物的沉淀速度；取上层清液，以12 000 r/min离心10 min，取上清液置于4℃
冰箱中。

取15μL上机分析。

瘤胃液：在正试期分别于饲喂前(记为0 h)，饲喂后1.5、3、6和9 h采集绵羊瘤
胃内容物，用60目尼龙袋过滤，立即取0.5 mL滤液加入预先加有0.5 mL甲醇并预冷的Eppendorf管中，立即上下颠倒混合10次。

放入冰水浴中带回实验室，
在4℃下12 000 r/min离心20min，取上清液于-20℃冷冻保存待测。

每期每只
羊连续采集3 d，把每一期每只羊3 d相同时间点的上清液按等体积混合。

取
15μL上机分析。

1.4 色谱条件
流动相：流动相A：双蒸水经0.45μm滤膜过滤后超声波脱气20 min。

流动相B：乙腈超声波脱气30 min。

流速：1 mL/min；柱温：30℃；激发波长：270 nm，发射波长：350 nm；洗脱方式：二元洗脱，流动相由双蒸水和乙腈组成，乙腈的洗脱浓度为0.01～3.50 min：40%、4.50～9.00 min：75%、11.0～15 min：
40%；进样量15μL。

1.5 操作步骤
1.5.1 标准溶液的配制
称取吲哚35.7 mg、粪臭素50.2 mg，用甲醇溶解后分别定容于25 mL棕色容量瓶中，此为粪臭素和吲哚的标准储备液，置于4℃冰箱保存。

1.5.2 标准曲线的制作
各取储备液按4级稀释制备成吲哚和粪臭素浓度分别为142.8、228.48、571.2、1 142.4和1.004、1.606 4、4.016、8.032 ng/mL标准应用液。

上样量15μL。

采用峰面积外标法进行定量，建立标准曲线。

2.1 色谱条件的优化
2.1.1 流动相组成
在流动相的组成比例上，乙腈的浓度对分离效果有较大的影响，乙腈浓度从25%逐渐递增到75%，发现乙腈低浓度时吲哚的出峰保留时间短，峰型较好，但粪臭素的出峰时间较长，有拖尾现象，而高浓度时粪臭素的出峰时间变短。

最后发现40%的乙腈有利于吲哚的出峰，75%的乙腈有利于粪臭素的出峰，且峰型较好。

等度洗脱未达到分离的理想效果，所以试验选择了梯度洗脱程序。

2.1.2 流动相梯度
在梯度洗脱程序的选择上，分别设计了6个不同的梯度洗脱程序，比较了在这些时间程序下的出峰效果和时间保留，最后选择合适的梯度洗脱程序。

结果表明，此程序适合本试验。

在确定的色谱条件下，吲哚和粪臭素的保留时间分别为6.598和7.973 min。

标准品和样品均能很好的分离。

图1～3
2.2 标准曲线建立
在确立的色谱条件下，以吲哚、粪臭素的浓度为横坐标，相应浓度值的峰面积为纵坐标，建立各自的标准曲线，其中吲哚的标准曲线方程为Y=95.658X+614.05，
R2=0.997 3，粪臭素的标准曲线方程为Y=678.35X-71.35，R2=0.994 7。

2.3 方法的重复性
把制备的各级标准液每个重复进样3次，计算峰面积的平均值、相对标准偏差。

结果表明，随着吲哚、粪臭素的浓度下降，峰面积的相对标准偏差(RSD%)变大。

因此，当待测样品中吲哚、粪臭素含量极低时，测定值的标准差将增大。

表1 2.4 回收率
分别称取40日龄肉鸡粪样4个加入4只10 mL玻璃试管，分成两个组，每组分别加入标准液原液0.5和1 m L，再加入2.5和2 mL甲醇溶解，其它处理方法同1.3。

采用峰面积外标法进行定量，计算粪臭素和吲哚的回收率，结果表明，虽然吲哚的回收率偏低而粪臭素的回收率偏高，但都很稳定；吲哚平均回收率为75.69%，粪臭素平均回收率为110.31%。

试验对绵羊瘤胃液样品的标准物质回收率并未进行测定。

在进行样品测定时，对测定值不再进行回收率的校正。

表2 2.5 绵羊瘤胃液中吲哚和粪臭素的含量
饲喂两种比例精料补充料日粮时，绵羊在饲喂前(0 h)及饲喂后1.5、3、6和9 h 点时瘤胃液中吲哚、粪臭素含量。

表3
绵羊无论饲喂高比例精料日粮还是低比例精料日粮，瘤胃液中吲哚测定值的标准差很大，表明试验绵羊个体间差异较大。

从各时间点上看，饲喂后1.5 h，高比例精料日粮时瘤胃液中吲哚含量极显著高于饲喂低比例精料日粮，其余各时间点两种日粮之间差异不显著。

吲哚含量的动态变化规律在两种日粮情况下基本相似，饲喂后1.5 h最高，3 h后变化平稳。

与吲哚含量动态变化规律相类似，粪臭素含量的动态变化规律在两种日粮情况下基本相似，饲喂后逐渐升高，到饲喂后3 h达最高值，之后逐渐下降，到饲喂后9 h 时基本接近饲喂前(0 h)的含量。

从各时间点上看，自饲喂后1.5 h起，高比例精料日粮时瘤胃液中粪臭素含量都有高于饲喂低比例精料日粮的趋势，尤其是在1.5、
3和9 h，差异接近0.05显著水平。

表3
2.6 肉鸡粪中吲哚和粪臭素的含量
列出不同日龄肉鸡在饲喂不同日粮时粪中的吲哚、粪臭素含量。

表4
相同日龄饲喂同一日粮的肉鸡粪中吲哚含量变化范围较大，特别是粪臭素含量变化范围更大，因此，对数据没有进行统计分析，只提供了平均值±标准差和范围值。

从吲哚含量来看，13～15、20～22日龄两个日龄组的肉鸡，饲用抗生素组的肉鸡粪中吲哚含量最低(744.66±318.43、1 214.01±510.00μg/kg)，依次是乳果糖组(917.84±206.61、1 343.10±131.80 μg/kg)和葡萄糖酸组(1 012.00±71.89、1 646.72±1 025.75μg/kg)，表明肉鸡在21日龄内，饲用抗生素降低粪中吲哚含量最有效。

34～36、40～41日龄两个日龄组的肉鸡，粪中吲哚含量较低的是饲用抗生素组(1 332.97±320.49、1 707.36±282.10μg/kg)和葡萄糖酸组(1 646.72±1 025.75、1 445.15± 955.06μg/kg)，含量最高的是乳果糖组(2 813.10±1 398.62、2 174.98±679.66μg/kg)。

葡萄糖酸组、乳果糖组肉鸡粪中吲哚含量到肉鸡34～36日龄时达到高峰值，40～41日龄时均呈下降趋势；而饲用抗生素组肉鸡粪中
吲哚含量从13～15日龄到40～41日龄呈现上升趋势。

从粪臭素含量来看，从13～15日龄到34～36日龄，肉鸡粪中的粪臭素含量变化不大(34～36日龄的乳果糖组除外)。

到40～41日龄时，肉鸡粪中粪臭素的含量
都有增加，其中，饲用抗生素组、乳果糖组增加最明显，葡萄糖酸组增加最少。

3.1 关于吲哚和粪臭素含量测定方法的建立
关于动物脂肪组织、肌肉组织、肠道内容物及粪样品中粪臭素和吲哚物质含量的测定，目前国内外已有较多报道，测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色
谱法(GC)、薄层层析法(TLC)和紫外分光光度计法。

HPLC因其高效、快速、灵敏
度高、重现性好、准确可靠等优点而得到越来越广泛的应用[4]。

在HPLC法中，
应用最多的当属反相高效液相色谱法(reversed-phase high-performance liquid
chromatographic，RP-HPLC)，而且大多选择紫外检器进行定性定量[8]，由于生物样品需要更微量化定量测定，许多研究者逐渐选用荧光检测器进行定性定量分析，与紫外检测法相比，荧光检测法检测灵敏度至少提高10倍以上，使研究者也能够根据选用的色谱柱规格型号灵活设计多样的洗脱方式[6，9]，并且，由于生物样品中天然具有产生荧光的物质很少，因此，色谱图的分离效果更好。

试验根据相关文献报道建立的方法具有分离时间短(10 min以内)、样品处理简单(避免了气相色谱法的繁琐样品预处理过程)、分离度和灵敏度高(吲哚142.8
ng/mL，绝对量2.142 ng/15μL；粪臭素1 ng/m L，绝对量0.015 ng/15μL)的特点。

尽管由于达到ng级定量后，标准曲线的线性(即相关系数)有所减低、回收率变差(但稳定性尚可)，但仍能满足吲哚、粪臭素痕量(trace)测定的需要。

3.2 饲喂两种水平的精料补充料时绵羊瘤胃液中吲哚和粪臭素含量的变化
有关反刍动物瘤胃液中吲哚、粪臭素的研究已有很多文献报道[10，11]。

通过细致的体外瘤胃微生物培养试验，提出了从色氨酸形成粪臭素的主要步骤(包括微生物种属、催化酶等)，而且，粪臭素的生成量与底物L-色氨酸的供给量、微生物种属有关[12]。

由于L-色氨酸经瘤胃微生物降解后形成的粪臭素可通过瘤胃上皮细胞吸收进入血循环，进而可导致反刍动物急性肺水肿和肺气肿(Acute bovine pulmonary emphysema and edema，ABPE)，因此，如何通过日粮调控手段调节瘤胃液中粪臭素的形成受到一些研究者的关注，已经证实，包括聚醚类离子载体抗生素如瘤胃素(monesin)、拉沙酪酸(lasalocid)等在内的许多抗生素都能抑制L-色氨酸降解生成粪臭素的速度和生成量[13～15]。

但是，在实际生产的典型日粮类型条件下(如高精料日粮、高粗料日粮)，有关瘤胃液中吲哚、粪臭素含量及其动态变化的研究报道较少。

试验测定了饲喂两种比例精料补充料日粮时，绵羊在前饲喂(0 h)及饲喂后1.5、3、6和9 h点时瘤胃液中吲哚、粪臭素含量的动态变化。

试验测得的瘤胃液中吲哚、粪臭素含量都低于许多文献的报道，其原因是相关研究
者在试验中大都按1 kg动物体重添加了0.35～0.4 g的L-色氨酸[16，17]，因此，测得的吲哚、粪臭素含量都明显高。

试验发现，绵羊瘤胃液中吲哚、粪臭素含量的动态变化规律在饲喂两种水平的精料补充料基本相似；高精料饲喂后1.5～9 h内，瘤胃液中的粪臭素含量普遍升高。

其原因可能是经过高精料饲喂的预试期，绵羊瘤胃微生物种群结构中乳酸杆菌、大肠杆菌比例升高，加快了精料中蛋白降解并释放色氨酸的速度和数量，从而使瘤胃液中的粪臭素含量升高。

3.3 不同日龄肉鸡在饲喂不同日粮时粪中吲哚、粪臭素含量的变化
有关猪粪、猪肉(背膘、肌肉)中粪臭素含量及其日粮调控对粪臭素形成影响的研究已有较多报道[4～6]，也见有产蛋鸡粪中吲哚、粪臭素含量的研究[7]，但是有关
肉仔鸡的粪中吲哚类物质(特别是粪臭素含量)随日龄动态变化以及日粮添加成分对其影响的研究报道较少见。

在试验中，13～15、20～22日龄两个日龄组的肉鸡，饲用抗生素组的肉鸡粪中吲哚含量最低，依次是乳果糖组和葡萄糖酸组。

34～36、40～41日龄两个日龄组的肉鸡，粪中吲哚含量较低的是饲用抗生素组和葡萄糖酸组，含量最高的是乳果糖组。

葡萄糖酸组、乳果糖组肉鸡粪中吲哚含量到肉鸡34～36日龄时达到高峰值，
40～41日龄时均呈下降趋势；而饲用抗生素组肉鸡粪中吲哚含量从13～15日龄
到40～41日龄呈现上升趋势。

从13～15日龄到34～36日龄，肉鸡粪中的粪臭素含量变化不大(34～36日龄的乳果糖组除外)。

到40～41日龄时，肉鸡粪中粪
臭素的含量都有增加，其中，饲用抗生素组、乳果糖组增加最明显，葡萄糖酸组增加最少。

研究表明，葡萄糖酸、乳果糖在动物的小肠很少被吸收，进入大肠后段被寄居的微生物降解形成挥发性脂肪酸，降低肠道酸度，调节肠道菌群构成，利于乳酸菌、双歧杆菌等有益菌的繁殖，而肠道中专性厌氧的乳酸菌正是降解L-色氨酸
生成粪臭素的主要菌种[18]。

试验中，肉鸡粪中的吲哚、粪臭素形成量不仅与日粮有关，还与肉鸡的日龄有关。

尽管抗生素能明显降低微生物降解生成吲哚、粪臭素
的数量，但正常菌群在雏鸡消化道完成定植过程需30 d左右[19]，而饲用抗生素
组肉鸡粪中粪臭素含量到40～41日龄大量增加，其原因可能与肉鸡肠道中微生物对饲用抗生素的适应性有关，或者是饲用抗生素的长时间添加反而会有利于产吲哚、粪臭素细菌的繁殖，详细机制有待进一步研究。

(1)建立了适于肉鸡粪中痕量吲哚、粪臭素测定的反相高效液相色谱法，方法具有
分离时间短(10 min以内)、样品处理简单、分离度好、灵敏度高(吲哚142.8
ng/mL，绝对量2.142 ng/15μL；粪臭素1 ng/ m L，绝对量0.015 ng/15μL)的特点。

(2)肉鸡粪中的吲哚、粪臭素含量不仅与日粮有关，还与肉鸡的日龄有关。

(3)饲喂两种水平的精料补充料时绵羊瘤胃液中吲哚、粪臭素含量的动态变化规律
在基本相似；高精料饲喂后1.5～9 h内，瘤胃液中的粪臭素含量普遍升高。

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