妥曲珠利对肉鸡血清生化指标的影响及停药后肝脏沉积的消减研究

妥曲珠利对肉鸡血清生化指标的影响及停药后肝脏沉积的消减
研究
孙燕;史雪萍;司倩倩;王述柏
【摘要】(Objective)The experiment was conducted to study the effects of Toltrazuril on serum biochemical indices and the dynamic elimination of its deposition in liver of broilers after withdrawal. (Method)288 1d AA broilers were randomly divided into 4 treatments with 6 replicates. The experimental groups (Group2,Group3 and Group4)were supplemented with 25 mg/L, 50 mg/L and 100 mg/L Toltrazuril in the conventional tap water respectively in 8~10 days old, the conventional tap water were supplied during other time., while the control group (Group1) was supplied with the conventional tap water. The experiment lasted for 42 days. (Result)The results showed that: 25 mg/L Toltrazuril had no significant effect on the activity of AMS (P>0.05),while the content of total protein and Glucose in serum increased significantly (P<0.05).The activity of AMS and the content of total protein of the two groups with 50 mg/L and 100 mg/L Toltrazuril were significantly lower than that of the control group (P<0.05).The activity of T-SOD of the groups with 25 mg/L, 50 mg/L and 100 mg/L Toltrazuril were significantly lower than that of the control group (P<0.05 or P<0.01). The deposition amount of Toltrazuril in broiler's liver appeared obviously to be correlated to the dosage of it. Toltrazuril could not be detected at the seventh day after withdrawal. With the extension of time after withdrawal, the elimination trend of Toltrazuril in liver accorded
with index function model. According to the model prediction, Toltrazuril's deposition amount in liver of Group2, Group3 and Group4 almost disappeared at 5.02 day, 6.10 day and 6.59 day after withdrawal respectively. (Conclusion)In conclusion, there was obvious dose-effect correlation between the dosage of Toltrazuril and broilers ' serum biochemical indices, so was the Toltrazuril ' s deposition amount in liver. The elimination of Toltrazuril in liver was fast after withdrawal.%（目的）本试验旨在研究饮水中添加不同水平妥曲珠利对肉鸡血清生化指标的影响及停药后在肝脏沉积量的消减特点。

(方法)选用288只1日龄AA肉鸡，随机分4组，每组6个重复。

对照组(1组)饮用常规自来水，2组、3组和4组于8~10日龄饮水中分别添加妥曲珠利25、50、100mg/L，其它时间饮用常规自来水，试验期42d。

(结果)结果表明，25mg/L妥曲珠利对肉鸡血清淀粉酶活性无显著影响(P>0.05)，可显著提高血清总蛋白和葡萄糖含量(P<0.05)；50mg/L 和100mg/L 妥曲珠利使血清淀粉酶活性和总蛋白含量显著降低(P<0.05)；25mg/L、50mg/L和
100mg/L妥曲珠利使血清总超氧化物歧化酶活性显著或极显著下降(P<0.05或
P<0.01)。

肝脏中妥曲珠利沉积量具有显著剂量效应。

停药7d，各试验组均已检测不出妥曲珠利。

药物沉积量下降趋势符合指数函数模型，经预测模型计算得出，2组、3组、4组分别于停药后5.02、6.10、6.59d肝脏中沉积的妥曲珠利基本消失。

（结论）综上所述，妥曲珠利对肉鸡血清生化指标的影响及其在肝脏中的沉积量均具有明显剂量效应，停药后肝脏药物的衰减速度较快。

【期刊名称】《家禽科学》
【年(卷),期】2015(000)010
【总页数】7页(P15-21)
【关键词】妥曲珠利;肉鸡;血清生化指标;肝脏;沉积量
【作者】孙燕;史雪萍;司倩倩;王述柏
【作者单位】青岛农业大学，山东青岛 266109;青岛农业大学，山东青岛266109;青岛农业大学，山东青岛 266109;青岛农业大学，山东青岛 266109【正文语种】中文
【中图分类】S858.319.79+5
据报道，全世界每年因鸡球虫病造成的经济损失高达80亿美元[1]。

因此，生产上有效防治球虫病至关重要，对此国内外学者和生产人员做了大量研究工作，广泛进行了各类药物的开发应用。

实践证明，妥曲珠利(Toltrazuril)能有效预防鸡、火鸡、水禽及鸽发生的所有球虫病[2]。

目前人们对妥曲珠利的抗球虫效果已较明了，而
对其作用机理及在体内的沉积消长规律知之甚少。

本试验研究了饮水中添加不同水平妥曲珠利对肉鸡某些血清生化指标的影响及其在肉鸡肝脏组织沉积和消减的特点，旨在探讨妥曲珠利在肉鸡生产上使用的安全性，为其安全科学使用提供理论依据。

1.1 试验材料主要仪器设备：高效液相色谱仪(Agilent 1100)、旋转蒸发仪(RE52-99)、紫外可见分光光度计(UV-5600(PC))、高速分散均质机(FJ-200)、组织捣碎
机(JJ-2)、电子精密天平(TP-313，精确度为1mg)等。

主要试剂：妥曲珠利(2.5g/100ml，购自山东明发兽药股份有限公司)；乙腈、乙
酸乙酯、磷酸二氢钾(均为分析纯，南京化学试剂有限公司生产)；色谱乙腈(美国Fisher Scientific公司生产)；妥曲珠利标准品(纯度98.0%，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)。

血清淀粉酶(amylase，AMS)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、血清总蛋白(total protein，TP)和葡萄糖(blood glucose，BG)测定试剂盒 (试剂盒均为南京建成生物工程有限公司生产)。

1.2 试验动物分组与处理以288只健康初生爱拔益加(AA)肉仔鸡为试验动物，随
机分为4组，每组6个重复，每重复12只鸡。

按常规饲养方法饲养管理，试验期42d。

各组鸡饲喂同一日粮，日粮以玉米、豆粕、鱼粉等为主要原料，根据美国NRC(1994年)肉鸡饲养标准配制，各营养素水平基本符合标准要求。

对照组(1组)全期饮用常规自来水，试验组(2组、3组和4组)分别于8日龄、9日龄和 10日
龄连续 3d饮水中分别添加 25mg/L、50mg/L和100mg/L妥曲珠利，其它时间
饮用常规自来水。

1.3 检测指标及方法
1.3.1 血清生化指标的检测分别于停药当天、停药7d、14d和21d，从每组各重
复随机取2只试验鸡，翼下静脉采血，分离血清于-80℃冰箱中保存待测。

采用试剂盒测定血清淀粉酶和总超氧化物歧化酶活性、血清总蛋白和葡萄糖含量[3]。

1.3.2 肝脏中妥曲珠利含量检测方法
1.3.
2.1 样品采集分别于停药当天及停药后第3天、5天、7天和14天，自每组
每重复随机抽取1只鸡，宰杀后立即取肝脏，去掉胆囊，用滤纸吸干表面血迹后
放入自封袋中，置-20℃冰箱保存备用。

1.3.2.2 样品处理与检测室温自然解冻肝
脏样品，先用组织捣碎机捣碎成均匀糊状，取3.00g于50ml匀浆管中，加10ml 生理盐水，再用高速分散均质机匀浆至均匀乳状液(要求无固体颗粒)。

匀浆液加
10ml乙酸乙酯萃取，5000r/min离心10min，取有机相，重复萃取3次合并有
机相。

将有机相用旋转蒸发仪于50℃蒸干，加1ml流动相将残渣溶解，0.45μm
微孔有机滤膜过滤，取滤液采用高效液相色谱(HPLC)检测[4]。

HPLC的色谱条件：WatersNova-Pak C18(3.9× 150mm)柱，柱温30℃，紫外检测波长为242nm；流动相为磷酸二氢钾缓冲液：乙腈(50:50)，流速1.0 ml/min；进样量20μl。

根据色谱峰峰面积，按标准曲线回归方程计算肝脏中妥曲珠利的含量。

1.3.
2.3 标准曲线的制作妥曲珠利储备液(100 μg/ml)的配制：称取10.00mg妥曲珠利标准品置于100ml棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

妥曲珠利标准液的配制：上述妥曲珠利储备液以流动相稀释，分别配制成0.4、1、2、4、5、6.25、10、12.5、20、25ng/ml的标准液。

按1.3.2.2色谱条件测定各标准液的吸收峰面积，每一水平重复测定3次取平均值。

以标准液浓度为横坐标，吸收峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.
2.4 回收率的测定标准品回收率：精确量取3、15、30、60、150、300μl妥曲珠利储备液，不加任何组织，按1.
3.2.2方法提取妥曲珠利，作HPLC分析，测其标准品回收率。

样品添加回收率：精确量取 3、15、30、60、150、300μl妥曲珠利储备液，加
入搅碎混匀后的对照组肝脏中，分别配制成妥曲珠利浓度为100、500、1000、2000、5000、10000ng/g的标准添加样品，按1.3.2.2方法提取妥曲珠利，作HPLC分析，测其样品添加回收率。

1.4 数据处理与统计分析试验数据采用SPSS17.0软件One-way ANOVA进行方差分析，LSD法进行多重比较，利用Eviews6.0软件建立妥曲珠利沉积量动态预
测模型[5]。

表中数据以“X±S”表示。

2.1 妥曲珠利对肉鸡血清生化指标的影响
2.1.1 妥曲珠利对血清淀粉酶活性的影响肉鸡血清淀粉酶活性见表1。

由表1可知，10日龄(停药当天)和17日龄(停药7d)，三个试验组血清淀粉酶活性均不同程度低于对照组 (1组)，2组与之差异不显著(P＞0.05)，3组和4组显著低于对照组(1组)和2组(P＜0.05)；24日龄(停药14d)和 31日龄(停药21d)，各组之间均无显
著差异(P＞0.05)。

2.1.2 妥曲珠利对血清总蛋白含量的影响肉鸡血清总蛋白含量见表2。

由表2可知，10日龄(停药当天)和17日龄(停药7d)，2组血清总蛋白的含量显著高于对照组
（1组）（P＜0.05），极显著高于3组和4组(P＜0.01)；而3组和4组显著低于对照组(P＜0.05)。

24日龄（停药14d），2组与对照组差异不显著（P＞
0.05），3组和4组仍显著低于对照组和2组（P＜0.05，P＜0.01）。

31日龄(停药21d)各组之间均无显著差异（P＞0.05）。

2.1.3 妥曲珠利对血清葡萄糖含量的影响肉鸡血清葡萄糖含量见表3。

由表3可知，2组血清葡萄糖的含量于10日龄(停药当天)和17日龄(停药7d)均显著高于对照组(1组)(P＜0.05)，24日龄(停药14d)和31日龄(停药21d)与之差异不显著(P＞0.05)。

3组和4组血清葡萄糖含量与对照组之间于各日龄均无显著差异(P＞0.05)。

2.1.4 妥曲珠利对血清总超氧化物歧化酶活性的影响肉鸡血清总超氧化物歧化酶活性见表4。

由表4可知，三个试验组血清总超氧化物歧化酶活性于各日龄均不同程度低于对照组(1组)。

10日龄(停药当天)和17日龄(停药7d)，2组显著低于对照组(P＜0.05)，3组、4组极显著低于对照组(P＜0.01)。

24日龄(停药14d)，三个试验组仍显著低于对照组(P＜0.05)。

31日龄(停药21d)各组间均差异不显著(P＞0.05)。

2.2 肉鸡肝脏组织中妥曲珠利沉积量及消减规律
2.2.1 妥曲珠利色谱图在检测方法中所述的色谱条件下，将妥曲珠利标准品利用乙腈溶解后配成100μg/ml，测得其保留时间为(7.00±0.2)min，见图1；而空白对照组肝脏提取液在上述保留时间无色谱峰，见图2；试验组肝脏提取液的色谱图见图3。

2.2.2 妥曲珠利标准曲线妥曲珠利标准曲线在0.4～25μg/ml浓度范围内，样品峰面积(S)与浓度(C)具有良好的线性关系 (S=44.184C+0.8708，R2= 0.9998)，见图4。

以3倍噪声为该检测方法的最低检测限，为74.45ng/g；以10倍噪声为该检测方法的最小定量限，为364.02ng/g。

2.2.3 回收率
2.2.
3.1 标准品回收率添加 100、500、1000、2000、5000、10000ng/g妥曲珠利标准品回收率分别为 90.97%、92.54%、98.74%、99.68%、98.32%、99.95%，总平均回收率为(96.70±3.91)%，相对标准偏差为
4.04%。

2.2.
3.2 样品添加回收率由表5可知，添加100、500、1000、2000、5000、10000ng/g妥曲珠利储备液在肝脏中的回收率为80.58%～85.90%，相对标准偏差均小于10%，可见，该检测方法可达到药物残留分析的要求。

2.2.4 肉鸡肝脏中妥曲珠利的沉积量由表6可知，肉鸡肝脏中妥曲珠利的沉积量，停药当天和停药3d，4组的沉积量显著高于3组(P＜0.05)，分别达1.30倍和1.42倍，极显著高于2组(P＜0.01)，分别达
3.41倍和3.60倍；停药5d，4组的沉积量显著高于2组和3组 (P＜0.05)，2组和3组差异不显著(P＞0.05)。

随停药时间的延长，各组沉积量均呈明显下降趋势。

停药7d，各试验组均已检测不到妥曲珠利。

2.2.5 肝脏中妥曲珠利沉积量的动态预测模型
根据表6中的试验结果绘制散点图，确定用指数函数模型：
对妥曲珠利在肝脏中的沉积动态进行模拟，建立其沉积量预测模型，其中，P为沉积量(ng/g)，A和B为待估参数，t为用药后的时间(d)。

将模型(1)线性化为：
采用Eviews6.0软件计算得知，第2组、3组、4组妥曲珠利在肝脏中的沉积动态预测模型分别为：
P1=4854.359071e-0.833208t，R2=0.943619，其半衰期为：
t(P/2)=0.831902d；
P2=10725.045648e－0.815517t，R2=0.906593，其半衰期为：
t(P/2)=0.849949d；
P3=14049.063251e－0.796153t，R2=0.897471，其半衰期为：
t(P/2)=0.870621d。

上述动态预测模型表明，妥曲珠利在肝脏中的半衰期为0.83～0.87d，由预测模型公式计算得知，2组、3组、4组分别于停药后 5.02、6.10、6.59d，肝脏中沉积
的妥曲珠利含量衰减到HPLC法的最低检测限(74.45ng/g)。

2.3 肝脏妥曲珠利沉积量与血清生化指标的相关性分析肝脏妥曲珠利沉积量(停药
当天)与血清生化指标的相关系数见表7。

由表7可知，肝脏妥曲珠利沉积量与血
清淀粉酶活性、总蛋白含量、葡萄糖含量和总超氧化物歧化酶活性均呈极显著的负相关关系(P＜0.01)。

3.1 抗球虫药对畜禽血清生化指标的影响沈建忠等[6]研究报道，7mg/kg和
9mg/kg马杜霉素可使鸡血清的天门冬氨酸氨基转移酶(AST)值异常升高,而对丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酐(Cre)和尿酸(UA)值均无明显影响；3mg/kg和5mg/kg 马杜霉素 (除21日龄时5mg/kg组鸡的AST值升高外)对上述血清生化指标均无
明显影响。

据报道，肉鸡感染球虫后血清总蛋白和白蛋白均呈下降趋势，使用地克珠利可显著提高总蛋白浓度，并维持白蛋白水平[7，8]；李蕴玉等[9]的研究结果
表明，所用中草药和球敌(有效成分为地克珠利)可以通过抑杀球虫，降低球虫感染鸡肠上皮的损伤，从而维持肠道正常的吸收功能，使血清蛋白浓度维持在正常水平。

本试验结果表明，25mg/L妥曲珠利对肉鸡血清淀粉酶活性无影响，显著提高血清总蛋白和葡萄糖含量；50mg/L和100mg/L妥曲珠利显著降低血清淀粉酶活性和总蛋白含量，对血清葡萄糖含量无显著影响；各添加剂量均使血清总超氧化物歧化酶活性显著下降。

停药21d后各试验组的各项指标均恢复正常。

同时，相关分析
表明，肝脏中妥曲珠利沉积量越大，对血清生化指标的不良影响越显著。

可见，妥曲珠利对肉鸡血清生化指标的影响程度具有明显剂量效应。

3.2 畜禽体内抗球虫药沉积量的影响因素文丽等[10]试验结果表明,混合艾美尔球
虫感染鸡组织中地克珠利的沉积量比健康鸡组织中的沉积量要低,且消除的更快,原因可能是混合艾美尔球虫的感染部位主要在肠道，而该药的吸收也主要集中在鸡的肠道,病变部位对药物的吸收有一定的影响，只有少部分被消化道吸收,从而使沉积在组织中的药物相应较少。

但郭永刚等[11]的研究结果显示，妥曲珠利在健康鸡和感染柔嫩艾美尔球虫的鸡体内的沉积无差别，可能是由于柔嫩艾美尔球虫的感染部位主要在盲肠段，而妥曲珠利的吸收主要集中在肉鸡的小肠段，所以病变对药物的吸收和沉积影响不大。

本试验的结果表明，妥曲珠利在肉鸡肝脏的沉积量具有显著剂量效应，添加量越多沉积量愈多；停药当天和停药3d，各试验组肝脏中妥曲珠利的沉积量远远高于规定的最高残留限量(600μg/kg)；随着停药时间的延长，下降趋势符合指数函数模型，且药物浓度的半衰期随着药物添加水平的升高而延长，停药5d，各试验组的药物浓度已低于规定的最高残留限量，停药7d，各试验组均已检测不出妥曲珠利。

可见，停药后妥曲珠利在肉鸡肝脏的衰减速度较快，生产上该药的停药期可以适当缩短。

高剂量妥曲珠利抑制血清淀粉酶活性、总蛋白含量及总超氧化物歧化酶活性。

肉鸡肝脏中妥曲珠利沉积量随饮水中添加量的增加而成倍增多，具有显著剂量效应。

停药后妥曲珠利的衰减速度较快，下降趋势符合指数函数模型，在肝脏中的半衰期为0.83～0.87d，停药后5.02～6.59d检测不到。

相关分析表明，肝脏中妥曲珠利的沉积量与各项血清生化指标呈极显著的负相关关系。

【相关文献】
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