基于新型核酸适配体传感器的赭曲霉毒素A检测研究

基于新型核酸适配体传感器的赭曲霉毒素A检测研究
闫好杰;卫敏;郭凯丽
【摘要】赭曲霉毒素A(OTA)是由曲霉菌属和青霉菌属等丝状真菌产生的次级代谢产物,分布广泛,已经成为普遍的食源性污染物.由于它具有肝毒性、肾毒性及致癌致畸等作用,对人们的健康构成了巨大的威胁,所以找到一种OTA的高灵敏快速检测方法对保证食品安全有至关重要的意义.电化学法具有设备简单、易携带、成本低、响应快等优点,结合核酸适配体(Apt)亲和力强、稳定性高、易于官能团修饰等优势,利用羧基化多孔碳(cPC)比表面积大等特性,以硫堇(Th)为电化学探针,制备了基于Apt和羧基化多孔碳-纳米金复合材料(cPC-AuNPs)的Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器,用于OTA的检测研究.不同电极的交流阻抗结果表明,Apt 成功固定在AuE上,Apt与cDNA成功结合.对试验参数进行优化,得到Apt的最佳孵育时间为1.5 h、Apt的最佳浓度为5 μmol/L、Apt与cDNA的最佳杂交时间为2.0 h、cDNA的最优量为9μL.在最优条件下,建立标准曲线,在10-6 ～ 10-2 μg/mL范围内,具有良好的线性关系,检出限为10-6 μg/mL.该方法操作简便、经济快速,适用于现场检测.%Ochratoxin A (OTA) is secondary metabolite produced by filamentous fungi of Aspergillus and Penicillium,and it is widely distributed and has become a common food borne contaminant.Ochratoxin A (OTA) has liver toxicity,nephrotoxicity and carcinogenic teratogenic effects,and has huge threat to the human health.Therefore,it is very important to find a sensitive and rapid OTA detection method for ensuring food safety.In this paper,a Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE sensor for rapid detection of OTA was prepared by using thionine (Th) as electrochemical probe based on aptamer and cPC-
AuNPs;and the Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE sensor possessed the advantages of electrochemical method such as simple
equipment,portability,low cost,and quick response,the superiorities of aptamer such as high affinity,high stability and easy modification of functional groups,as well as the characteristics of carboxylated porous carbons such as large specific area.The results of electrochemical impedance spectroscopy showed that the aptamer was successfully immobilized on AuE and combined with cDNA.The experimental parameters were optimized as follows:the optimum incubation time of aptamer was 1.5 h,the optimum concentration of aptamer was 5
μmoL/L,the optimum hybridization time between aptamer and cDNA was 2 h,and the optimum amount of cDNA was 9 μL.Under the optimal conditions,the standard curve was established,which had good linear relationship within 10-6 μg/mL to 10-2 μg/mL,and the detection limit of OTA was l0-6 μg/mL.The mehtod is easy to operate,econ omic,fast,and is suitable for filed detection.
【期刊名称】《河南工业大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2018(039)001
【总页数】6页(P93-97,132)
【关键词】赭曲霉毒素A;核酸适配体;电化学传感器;羧基化多孔碳-纳米金
【作者】闫好杰;卫敏;郭凯丽
【作者单位】河工业大学粮油食品学院,河南郑州450001;河工业大学粮油食品学院,河南郑州450001;河工业大学粮油食品学院,河南郑州450001
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.2
0 前言
赭曲霉毒素A（OTA）是由曲霉菌属和青霉菌属等丝状真菌产生的次级代谢产物，经常出现在各种食物中，包括小麦、玉米、咖啡、香料、啤酒、葡萄及其衍生产品，动物饲料和饲料产品[1-3]。

它具有肝毒性、肾毒性、免疫毒性及致癌致畸作用，
现已被国际癌症研究机构（IARC）列为可能的人类致癌物（2B级）[4]。

因为OTA分布广泛，且作为普遍的食源性污染物，已经对人们的健康构成了巨大的威
胁[5]。

因此，找到一种灵敏检测OTA的方法对保证食品安全以减少食品中的
OTA对人体健康的危害有至关重要的意义[6]。

食品中检测OTA的传统方法包括高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱、荧光法
等[7]。

这些方法灵敏度高、稳定性强，但样品前处理比较复杂，耗时比较长，仪
器成本高，而且不易携带，因此不能满足现场检测的需求[8]。

电化学法具有设备
简单并易于小型化、成本低、响应快速等优点，已引起科研者的关注[9]。

近年来，电化学免疫传感器法因仪器简单、操作方便、时间短等优点，已成为OTA现场检测的一种重要方法[10-12]。

但是，抗体在制备过程中比较依赖动物，耗时长且稳
定性差。

与其相比，核酸适配体可经过体外筛选或者化学法合成，制作简单，稳定性好，可以替代抗体作为生物识别分子，目前基于核酸适配体的电化学传感器已被广泛应用于OTA的检测研究[14-16]。

在电化学核酸适配体传感器的制备过程中，生物分子的固定是关键[17]。

由于多孔
炭具有较大的比表面积、导电性良好等特点，已被成功地用于固定生物分子[18]。

另一方面，纳米金因其具有良好的导电性和生物相容性，已被广泛应用于OTA的检测研究[19-21]。

作者以羧基化多孔炭为基质，制备了羧基化多孔炭-纳米金复合材料作为生物载体，以硫堇为电化学信号探针，以金电极为工作电极，制备新型
Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器，用于OTA的检测研究。

1 材料与方法
1.1 材料
OTA核酸适配体(Apt)5’-GAT-CGG-GTGTGG-GTG-GCG-TAA-AGG-GAG-CAT-CGG-ACA-3’和捕获探针(cDNA)5’-CCA-CAC-CCGATC-3’在生工生物工程 (上海)股份有限公司合成；OTA：Sigma公司；铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])、亚铁氰化钾(K4[Fe(CN)6]·3H2O)：天津市瑞金特化学品有限公司；6-巯基-1-己醇(MCH)、硫堇 (Th)：上海源叶生物科技有限公司；氯金酸 (HAuCl4)：上海三爱思试剂有限公司。

试验中所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备
CHI660D型电化学工作站：上海辰华仪器有限公司；试验以饱和甘汞电极
（Ag/AgCl）为参比电极，铂丝电极（Pt）为对电极，金电极（AuE）为工作电极。

1.3 方法
1.3.1 cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器的制备
cPC-AuNPs-cDNA根据文献[22]制备。

取5.0 μL的1 μmol/L的Apt滴于处理
过的金电极表面，37℃孵育 2 h，然后滴加5.0 μL的 1 mmol/L的MCH于金电
极表面，37℃孵育1 h，滴加5.0 μL制备好的cPC-AuNPs-cDNA于修饰电极表面，37℃孵育2 h，即得 cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器。

1.3.2 传感器对OTA的检测
取5.0 μL 5 mmol/L的 Th滴于 cPC-AuNPscDNA/Apt/AuE传感器表面，37℃
孵育20 min，在50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4、0.2 mol/L NaCl、1.0 mmol/L EDTA)溶液中用差分脉冲伏安法测量，Th通过S-Au键与AuNPs结合而固定到电极表面，从而产生电信号；取5.0 μL的1 ng/mL的OTA滴于Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器表面，37℃孵育20 min，在50 mmol/L Tris-HCl溶液中测量时，由于OTA与Apt结合，导致Th从电极上脱落，因此电信号降低，根据
加入OTA前后的电流变化达到检测目的。

2 结果与分析
2.1 不同电极的电化学行为
用交流阻抗分别对裸电极 AuE(a)、Apt/AuE(b)、cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE(c)在 10 mmol/L 的[Fe(CN)6]3-/4-(含0.10 mol/L KCl)溶液中进行表征。

从图1可以看出,AuE(a)电阻最小，阻抗为52 Ω，主要是由于裸电极电子传递效率高。

Apt/AuE(b)阻抗为193 Ω，与裸电极相比电阻明显增大，是因为核酸适配体固定
在电极上之后，单链DNA磷酸骨架带负电荷，与带负电荷的[Fe(CN)6]3-/4-互相排斥，阻碍了电极表面的电子转移。

cPC-AuNPscDNA/Apt/AuE(c)的阻抗最大，达到了1 033 Ω，这是因为cPC-AuNPs-cDNA与Apt杂交连接到电极表面以后，电极表面的负电荷密度增大，所以阻抗明显增大。

这些试验结果表明，互补链cDNA与Apt成功固载在电极上。

图1 不同电极在10 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-(含0.10 mol/L KCl)溶液中的交流阻
抗图谱Fig.1 Electrochemical impedance spectroscopy of different electrodes in 10 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-solution containing 0.1 mol/L KCl 2.2 Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器对OTA的检测
在相同的试验条件下，用Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器对OTA进行检测。

由于多孔炭火有大的比表面积，能固载更多的cDNA杂交到电极表面，也能
为AuNPs提供更多的结合位点，从而使更多的Th通过S-Au键与AuNPs结合，
产生更大的电流信号。

如图2所示，Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器(a)在50 mmol/L的Tris-HCl溶液中的 DPV峰电流值为 4.738 μΑ，
OTA/Th/cPCAuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器(b)的DPV峰电流为2.222 μΑ，加入 OTA 前后，电流变化(ΔIp)为2.516 μA。

这是因为OTA与核酸适配体的结合力远大于cDNA和核酸适配体的杂交，所以当OTA存在时，OTA与cDNA竞争性结合核酸适配体，使核酸适配体构象发生变化，导致cPC-AuNPs-cDNA从电极上脱落，电极表面上cPC-AuNPs-cDNA随之减少，结合在cPC-AuNPs-cDNA复合材料上的硫堇也随之减少，因此，Th的峰电流减小，达到检测OTA 的目的。

图2 1 ng/mLOTA 孵育前（a）和孵育后（b）Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE 传感器在50 mmol/L的Tris-HCl溶液中的差分脉冲曲线Fig.2 DPV responses of Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE before(a)and after(b)incubation of 1
ng/mL OTA in 50 mmol/L Tris-HCl buffer
2.3 cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器的试验条件优化
2.3.1 Apt孵育时间的优化
Apt的不同孵育时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）对Th/cPC-AuNPs-
cDNA/Apt/AuE传感器氧化峰电流的影响结果如图3所示。

图3 核酸适配体不同孵育时间对Th/cPCAuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器的影响Fig.3 The effect of aptamer on Th/cPC-AuNPscDNA/Apt/AuE sensor with different incubation time注：Apt浓度:5 μmol/L;Th 浓度:5 mmol/L；cDNA 的量:9 μL。

由图3可知，孵育时间从0.5 h增加到1.5 h时，Th的氧化峰电流呈增大趋势，在1.5 h时达到最大，为4.693 μA，当时间从1.5 h延长到2.5 h时，峰电流逐渐下降。

这是因为Apt通过硫金键与金电极结合，而且结合力较强，随着时间的增
加，核酸适配体固载量也不断增加，结合的cPCAuNPs-cDNA也就越多，电极表面吸附的Th也越来越多。

而cPC和AuNPs都具有良好的导电性，可以加速电极表面电子的转移，使得电极上Th峰电流信号增大。

当电极表面吸附的Th达到饱
和以后，随着时间的延长Apt活性减弱，且Apt量过大时会抑制电子在电极表面
与缓冲液之间的转移，所以峰电流又减小。

因此，核酸适配体最佳孵育时间为1.5 h。

2.3.2 核酸适配体浓度的优化
不同浓度(3、5、7、9、10 μmol/L)的核酸适配体对Th/cPC-AuNPs-
cDNA/Apt/AuE传感器氧化峰电流的影响结果如图4所示，当浓度从3 μmol/L
到5 μmol/L时，电流增加的幅度大，从5 μmol/L到7 μmol/L，电流增加的幅
度平缓，7 μmol/L到10 μmol/L，电流虽在增大，与3 μmol/L到7 μmol/L相比，幅度较小。

这是因为随着核酸适配体浓度的增加，Th的氧化峰电流就越大。

考虑到实际情况，核酸适配体浓度为5 μmol/L时既能满足最佳试验要求，又能节省材料。

所以将5 μmol/L作为最佳浓度，对应的峰电流为5.118 μA。

图4 不同浓度的核酸适配体对Th/cPC-AuNPscDNA/Apt/AuE传感器的影响Fig.4 The effect of aptamer with different concentrations on Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE sensor注：Th 浓度:5 mmol/L；cDNA 的量:9 μL。

2.3.3 核酸适配体与cDNA不同杂交时间的优化
核酸适配体与cDNA的不同杂交时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对 Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器氧化峰电流的影响结果如图5所示，核酸适配体
与cDNA的杂交时间在2.0 h时，杂交作用达到最大，峰电流达到最大4.797 μA，这是因为随着杂交时间变长，Apt与cDNA结合的数量越来越多，因此Th的氧化峰电流逐渐增大。

在2.0 h之后，峰电流减小，是因为电极表面连接了过多的cDNA，阻碍了电极表面与缓冲液之间的电子转移。

所以核酸适配体与cDNA的
最佳杂交时间为2.0 h。

图5 核酸适配体与cDNA的不同杂交时间对Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器的影响Fig.5 The effect of the cDNA and aptamer’s hybridization time on the Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE sensor注：Apt浓度:5 μmol/L;Th 浓度:5 mmol/L；cDNA 的量:9 μL。

2.3.4 cDNA量的优化
不同 cDNA 的量（3、5、7、9、11 μL）对 Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE 传感器氧化峰电流的影响结果如图6所示，从3 μL到9 μL过程中，cDNA与Apt碱基互补配对的量在逐渐增加，电信号不断增大，在滴加9 μL时的峰电流最大，为5.386 μA，在9.0 μL 之后，峰电流减小，是因为电极表面cDNA的量过多，阻碍了电极表面与缓冲液之间的电子转移。

所以9 μL是最佳的cDNA的量。

图6 cDNA的不同量对Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器的影响Fig.6 The effect of cDNA loading amount on Th/cPC-AuNPs-cDNA/Apt/AuE sensor 注：Apt浓度:5 μmol/L;Th 浓度:5 mmol/L。

2.3.5 标准曲线的建立
OTA浓度的对数（lg COTA）与孵育前后峰电流差的关系如图7所示，最优条件下，在1.0×10-6～1.0×10-2μg/mL范围内，lg COTA与峰电流差呈线性相关，线性方程为ΔIp=2.435 5 lg COTA+0.380 2，决定系数R2=0.983，检出限是1.0×10-6μg/mL。

图7 1.0×10-6～1.0 μg/mL 范围内 lg COTA与孵育前后峰电流差关系曲线Fig.7 Relationship curve between△Ip and lg COTA in the range of 1.0×10-6to 1.0 μg/mL on the cPCAuNPs-cDNA/Apt/AuE注：内插图为1.0×10-6～1.0×10-2μg/mL 范围内，lg COTA与孵育前后传感器的电流信号差值的关系曲线。

3 结论
本试验采用cPC-AuNPs-cDNA与核酸适配体结合，以Th为电化学探针构建新型Th/cPCAuNPs-cDNA/Apt/AuE传感器用于OTA的检测。

在线性范围1.0×10-6～1.0×10-2μg/mL 内，OTA 浓度的对数与峰电流差呈线性关系，得出检出限为1.0×10-6μg/mL，符合试验要求，适用于OTA的现场检测。

参考文献：
［1］PETZINGER E，ZIEGLER K.Ochratoxin A from a toxicological perspective ［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2010，23（2）:91-98.
［2］PFOHLLESZKOWICZ A，MANDERVILLE R A.Ochratoxin A:An overview on toxicity and carcinogenicity in animals and humans［J］.Molecular Nutrition&Food Research，2007，51（1）:61-69.
［3］BIRCAN C.Incidence of ochratoxin A in dried fruits and co-occurrence with aflatoxins in dried figs［J］.Food and Chemical Toxicology ，2009，47（8）:1996-1998.
［4］RIVAS L，MAYORGAMARTINEZ C C，QUEADAGONZÁLEZ D，et bel-free impedimetric aptasensor for ochratoxin A detection using iridium oxide nanoparticles［J］.Analytical Chemistry，2015，87（10）:5167-5172.
［5］MARTLBAUER E，USLEBER E，DIETRICH R，et al.Ochratoxin A in human blood serum-retrospective long-term data［J］.Mycotoxin Research，2009，25（4）:175-186.
［6］WANG Q，CHEN M，ZHANG H，et al.Solidstate electrochemiluminescence sensor based on RuSi nanoparticles combined with molecularly imprinted polymerforthe determination of ochratoxin A
［J］.Sensors and Actuators B Chemical，2016，222:264-269.
［7］KRSKA R，SCHUBERT-ULLRICH P，MOLINELLI A，et al.Mycotoxin analysis:an update［J］. Food Additives and Contaminants，2008，25（2）:152-163.
［8］MARAGOS C M，BUSMAN M.Rapid and advanced tools for mycotoxin analysis:a review［J］.Food Additive and Contaminants:Part A，2010，27（5）:688-700.
［9］DAS J，KELLEY S O.Protein detection method:USA，2663857 A2［P］.2013.
［10］MUCHINDU M，IWUOHA E，POOL E，et
al.ElectrochemicalOchratoxin A immunosensor system developed on sulfonated polyaniline［J］.Electroanalysis，2011，23（1）:122-128. ［11］BONEL L，VIDAL J C，DUATO P，et al.Ochratoxin A nanostructured electrochemical immunosensors based on polyclonal antibodies and gold nanoparticles coupled to the antigen［J］.Analytical Methods，2010，2（4）:335-341.
［12］KHAN R，DHAYAL M.Chitosan/polyaniline hybrid conducting biopolymer base impedimetric immunosensor to detect ochratoxin A ［J］.Biosensorsand Bioelectronics，2009，24（6）:1700-1705.
［13］马希尼.生物分析中的核酸适配体［M］.屈锋，译.中国：化学工业出版社，2010.
［14］BONEL L，VIDAL J C，DUATO P，et al.An electrochemical competitive biosensor for ochratoxin A based on a DNA biotinylated aptamer ［J］.Biosensors and Bioelectronics，2011，26（7）:3254-3259.
［15］TONG P，ZHANG L，XU J J，et al.Simply amplified electrochemical aptasensor of Ochratoxin A based on exonuclease-catalyzed target recycling ［J］.Biosensors and Bioelectronics，2011，29（1）:97-101. ［16］PUGLIESE A，AMOROSO F A，CAPPUCCINO G，et
al.Electrochemical aptasensor for the determination of Ochratoxin A at the Au electrode modified with Ag nanoparticles decorated with macrocyclic ligand ［J］.Electroanalysis，2013，25（8）:1847-1854.
［17］SHENG L，REN J，MIAO Y，et al.PVP-coated graphene oxide for selective determination of ochratoxin A via quenching fluorescence of free aptamer［J］.Biosensors and Bioelectronics，2011，26（8）:3494-3499. ［18］WEI M，WANG J.A novel acetylcholinesterase biosensorbased on ionicliquids-AuNPsporous carbon composite matrix for detection of organophosphate pesticides［J］.Sensors and Actuators B Chemical，2015，211:290-296.
［19］HUANG K J，SHUAI H L，CHEN Y yered molybdenum selenide stacking flowerlike nanostructure coupled with guanine-rich DNA sequence for ultrasensitive ochratoxin A aptasensor application
［J］.Sensors&Actuators B Chemical，2016，225:391-397.
［20］HAO N，JIANG L，QIAN J，et al.Ultrasensitive electrochemical Ochratoxin A aptasensor based on CdTe quantum dots functionalized graphene/Au nanocomposites and magnetic separation
［J］.JournalofElectroanalytical Chemistry，2016，781:332-338.
［21］JIANG L，QIAN J，YANG X，et al.Amplified impedimetric aptasensor based on gold nanoparticles covalently bound graphene sheet
for the picomolar detection of ochratoxin A［J］.Analytica Chimica Acta，2014，806:128-135.
［22］袁蓓.基于电化学传感器的黄曲霉毒素B1及赭曲霉毒素A检测方法研究［D］.郑州：河南工业大学，2016.。