盐酸法舒地尔对NF200在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中表达的影响

盐酸法舒地尔对NF200在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中表达
的影响
顾镜月;邵巍;孟庆云;穆国军
【摘要】目的:利用新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)动物模型,检测HIBD脑组织中神经丝蛋白-200 (Neurofilaments Protein-200,NF200)表达的动态变化,观察盐酸法舒地尔(Fasudil Hydrochloride Injection)对大鼠NF200表达的影响及对神经损伤后的保护与修复作用.方法:将新生7d龄Wistar大鼠120只,随机分为假手术组(Sham 组,40只),缺氧缺血作用(HIBD组,40只),法舒地尔治疗组40只,每组再分为6h、12h、24h、72h、7d,5个亚组.Sham组只做左颈总动脉分离.HIBD组,法舒地尔组做左侧颈总动脉永久性结扎及缺氧处理后,分别腹腔注射生理盐水和法舒地尔(10mg/kg).采用免疫组化法检测海马区NF200的表达.结果:Sham组:可见NF200有微量表达,各组间无统计学意义.HIBD组:NF200阳性细胞在造模6h出现表达,12h开始下降,24h降到最低,此后逐渐升高.与Sham组NF200阳性细胞数比较差异有统计学意义(P＜0.01).法舒地尔治疗组各时间点NF200的表达均高于HIBD组,差异有统计学意义(P＜
0.01).HIBD组和法舒地尔组阳性细胞数明显多于Sham组,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:法舒地尔可能通过抑制Rho/Rock通路促进轴突再生和修复进而使
NF200的表达增加.
【期刊名称】《黑龙江医药科学》
【年(卷),期】2014(037)001
【总页数】2页(P5-6)
【关键词】缺氧缺血性脑损伤;NF200;法舒地尔;神经再生;新生鼠
【作者】顾镜月;邵巍;孟庆云;穆国军
【作者单位】佳木斯大学附属第一医院儿内一科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学,黑龙江佳木斯154007;佳木斯大学附属第一医院儿内一科,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学,黑龙江佳木斯154007
【正文语种】中文
【中图分类】R965;R743
中枢神经系统(Centralnervous systemCNS)损伤后，损伤的轴突被存活的轴突以侧枝出芽的方式取代。

Rock激活最终抑制中枢神经细胞轴突生长。

NF200是中枢和外周神经系统的重要骨架成分，而且对维持神经元的形态和轴浆运输以及与损伤神经的修复都具有极其重要的意义。

本研究通过观察Rock抑制剂法舒地尔对HIBD后脑组织中NF200的表达，探讨法舒地尔对缺血性脑损伤的保护作用。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物及分组
健康清洁级Wistar大鼠(280±20)g(购自大连医科大学实验动物中心)运送至佳木斯大学动物实验室合笼，所生7d龄清洁级Wistar大鼠体重(12.5±3)g，共120只，雌雄不限，均为室温22℃、湿度50%条件下常规喂养。

将96只大鼠按数字随机法分为3组：Sham组(n=40只；仅手术分离左侧颈总动脉，不做永久性结扎，缝合手术切口后，不做低氧处理)、HIBD模型组(n=40只；永久性结扎左侧颈总动脉加低氧处理，且于缺氧后10min腹腔注射生理盐水)、法舒地尔治疗组
(n=40只；永久性结扎左侧颈总动脉加低氧处理，且于缺氧后10min腹腔注射法舒地尔溶液(10mg/kg))。

各组均按6h、12h、24h、72h 及 7d，6 个观察时间段随机等分。

1.1.2 主要试剂及来源
混合气体(氮气：92%，氧气：8%)；盐酸法舒地尔注射液；Nogo-A抗体 NF200抗体；SABC(兔IgG)试剂盒；磷酸盐缓冲液(PBS)；枸橼酸盐抗原修复液；DAB
显色剂；多聚赖氨酸防脱玻片；抗体稀释液。

1.2 实验方法
1.2.1 新生大鼠缺氧缺血脑损伤模型制备
新生7d龄清洁剂健康Wistar大鼠称重并编号，参照Rice法制备。

将大鼠乙醚吸入麻醉后取仰卧位，四肢固定，取颈正中切口，结扎左侧颈总动脉；缝合切口后放回原饲养环境中恢复2～4h入2000mL密闭容器，置于37℃水浴中，维持容器
内温度36℃，以2～3L/min的速度输入8%的氧气和92%的氮气的混合气体，持续2～4h。

Sham组只做左颈总动脉分离后不结扎，直接缝合切口并不做缺氧处理；HIBD组腹腔注射生理盐水0.25mL/kg；治疗组在HIBD后即刻给予法舒地尔
10mg/kg腹腔注射，每日一次。

分别于6h、12h、24h、72h、7d不同时间点断颈处死。

1.2.2 取材及切片制作
各组大鼠分别于 6h、12h、24h、72h、7d不同时间点断颈处死。

各组新生大鼠
于各自规定时间行水合氯醛麻醉，仰位固定于手术板上，提起剑突下缘腹部皮肤，剪刀剪开，沿胸骨两侧剪断肋骨剪开心包暴露心脏。

用1mL注射器针头自心尖处插入左心室，剪开右心耳，连接20mL医用无菌注射器接穿刺针小心插入左心室，持续注入灭菌生理盐水，待心脏流出液清亮肝脏转呈灰白色后再灌注4%多聚甲醛100mL至大鼠僵硬，开颅取脑组织，将全脑组织固定于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲
液中置72h，待脑组织下沉后，取出进行石蜡固定，4℃冰箱保存。

将固定好的大脑标本自视交叉后约1mm为第一切点，冠状位后约3mm为第二切点修快，将快修好后流水洗涤过夜，梯度酒精脱水，二甲苯透明，侵蜡，放入盛有蜡溶液的铝制包埋盒中，迅速冷却凝固后去除铝制包埋盒。

用石蜡切片机将蜡块连续切片，片厚约5μm。

然后经展片、捞片、烤片后保存备用。

1.2.3 NF200免疫组化染色
石蜡切片常规脱蜡至水；把石蜡切片浸于枸缘酸修复液(pH6.0)中，中档火(750W)微波炉加热至沸腾，间隔10min，室温下自然冷却20min，冷却后PBS(pH7.2～7.6)洗涤2次；每张切片滴加5%BSA封闭液，37℃30min。

甩去多余液体，不洗；滴加1：100稀释的一抗(NF200)，4℃过夜(16h以上)。

PBS(pH7.2～7.6)冲洗
5m in×3次；滴加二抗生物素化山羊抗兔IgG(或鼠、人IgG)，37℃30min。

PBS(pH7.2～7.6)洗5min×3次。

滴加试剂 SABC-AP，
37℃30min.PBS(pH7.2～7.6)洗10min×5次。

DAB显色［DAB显色试剂盒(AR1022)］，苏木素轻度染。

脱水，透明，封片。

显微镜观察。

阴性对照：用相
同量的PBS代替一抗(NF200)，其余步骤同前。

1.2.4 免疫组化结果判定
胞浆染成棕褐色或棕黄色为NF200阳性细胞。

采用阳性细胞计数法，每张切片随即选取5个不重复的视野，在400倍物镜下计数/NF200阳性细胞数，计算平均值，以均数±标准差表示。

1.3 统计学处理
采用SPSS.19.0软件。

对各组数据进行正态性检验和方差齐性检验比较各组数据
均数，进行单因素方差。

数据采用均数±标准差表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

(注：作统计分析时将死亡大鼠数据剔除)。

2 结果
NF200免疫组化检查结果：Sham组：可见NF200有微量表达，各组间无统计学意义，见表1。

HIBD组：NF200阳性细胞在造模6h出现表达，12h开始下降，24h降到最低，此后逐渐升高。

与Sham组NF200阳性细胞数比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

见表1。

法舒地尔治疗组各时间点NF200的表达均高于HIBD组，差异有统计学意义(P＜0.01)。

HIBD组和法舒地尔组阳性细胞数明显多于Sham 组，差异有统计学意义(P＜0.01)见表1。

表1 各组大鼠不同时段NF200阳性细胞数比较(，n=8)注：a与正常组相比较，P ＜0.05；b与HIBD组相比较，P＜0.05。

组别 6h 12h 24h 72h 7d Sham 组
6.86±0.86
7.02±1.13 7.06±1.13 7.12±0.96 7.08±1.01 HIBD 组9.32±1.24a
8.62±1.31a 7.46±1.03a 8.48±1.57a 9.34±1.80a治疗组10.24±1.49ab
9.74±1.54ab 9.08±1.24ab 10.06±1.32ab 10.66±1.66ab F值 102.013 52.350 44.047 63.502 70.009 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01
3 讨论
Rock可通过直接激活肌球蛋白轻链磷酸酶的活性使平滑肌细胞持续收缩，导致血管痉挛，进一步加重组织缺血。

CNS内神经元的损伤与血管痉挛与Rock因各种
病理因素被异常激活有关。

正常情况下，Rock的催化活性中心被其内结构域通过折返机制所抑制，使其不能与ATP及其下游底物大分子蛋白结合［1］。

当发生HIBD时损伤的轴突被存活的轴突以侧枝出芽的方式取代，从而恢复其功能［2］，修复受损的神经元［3］。

在这一过程中内环境中的一些抑制因子直接或间接地激活细胞内Rho信号传导通路，引起肌动蛋白骨架的重组和轴突生长锥的塌陷，使
阻断轴突再生过程被阻断［4～6］，抑制轴突的再生。

NF是构成神经元胞体和神经轴突细胞骨架的主要成分，在维护神经元的功能和轴浆转运等一系列与脊髓损伤修复相关的病理、生理变化中发挥着重要作用［7］。

神经未受损伤时胞体内仅含少量或不含NF200，而轴索中大量表达。

损伤区内的神经细胞在各种不利因素的
影响下会出现变形坏死、结构破坏及细胞崩解，失去其原有的功能。

而损伤区外的邻近神经元在则开始大量合成及积存NF200，以适应神经再生的需要，最终修复受损的神经元。

故此NF200作为反应神经元功能，指示轴突再生状况的一个间接指标［8，9］。

法舒地尔可能通过与ATP竞争Rock催化结构域的ATP结合位点来抑制Rock活性。

有研究证实法舒地尔在脑出血的治疗疗效显著［10，11］。

本实验观察到在应用法舒地尔后NF200在12h，24h，72h，7d的表达均高于HIBD组，提示法舒地尔可改善轴突再生环境，促进神经轴突再生和修复。

其机制可能为盐酸法舒地尔抑制了Rock的活性，从而导致细胞骨架重建，启动细胞分化的过程，同时通过干扰 Rock信号通路与其他信号传导通路之间本来相对平衡稳定的内环境，关闭或激活下游途径中与细胞分化相关的基因，从而促进NF200表达的升高，促进神经轴突再生和修复［12］。

因此，法舒地尔可能通过抑制
Rho/Rock通路，促进轴突再生和修复进而使NF200的表达增加。

这些都提示，法舒地尔可能从以上环节对缺血性脑损伤发挥了较好的保护作用。

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