大肠杆菌K88相关产品的研制
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表3：免疫鸡群大肠杆菌k88抗体效价
样品编号
1
2 6
3 6
4 6.5
5 7.5
6 8
7 9
8 8
9 9
10 11
11 10
12 10
13 10
抗体效价 3 （log2）
免疫鸡群的抗体效价变化
2 3 4 5 6 7 8 采样时间 9 10 11 12 13
＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2
2 重组乳酸菌选育株对小鼠肠粘液的体外粘附实验
名称 粘液1 粘液2 灌肠 活菌数 （cfu/mL） 1.63× 109 1.73× 109 1.28× 109 原液活菌总数 （cfu/mL） 4.7× 109 4.7× 109 4.7× 109 体外粘附率 64.2% 63.2% 72.8%
2 小鼠肠道内容物sIgA （mg/L）测定结果
组别 生理盐水 第1批 50.54±27.80a 第2批 68.17±6.64b 第3批 70.79±4.52a 第4批 65.27±13.44a
LP
疫苗组 工程菌组
60.05±20.51a
66.84±14.88a 94.02±26.62a
71.52±7.20b
原液(log)
7.62 7.67 7.71 7.78 7.7 7.69 7.84 7.61 7.72 7.7 7.68 7.89 7.98 7.78 7.53 7.66 7.76
耐胆盐对数差
＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＜2 ＞2 ＞2
耐酸对数差
实验一、重组乳酸菌的PCR鉴定及表达产物的
SDS-PAGE和West-blot分析
技术路线
重组菌活化、增菌 及质粒的提取 产毒素大肠杆 菌疫苗的制备 免疫动物 多克隆抗体的 制备 鉴定 重组菌的诱导 表达
PCR鉴定
Western-blot
SDS-PAGE
确定为携带诱导肽和抗原基 因的重组乳酸菌
1、重组乳酸菌的分子鉴定—PCR鉴定
一、鸡抗猪产肠毒素大肠杆菌 （K88）卵黄抗体的研制
Why do we choose yolk antibody（IgY） ?
1、抗体水平高 卵黄抗体所含有的抗体滴度大于血清中
的抗体滴度，作为饲料添加剂具有更高的免疫保护效率。 生产、加工。
2、稳定性高 卵黄抗体具有徆高的热稳定性，便于机械 3、安全性高 卵黄抗体可以用来防治相应的病原体引起
大肠杆菌口服疫苗的研制
汇报人:范群平 生物制品实验室
What is vaccine？
广义的疫苗是 为了预防、控制传染病的发生和流行而接种于 机体的预防性生物制品。 生物制品，是指用微生物戒其毒素，人戒动物 的血清、细胞等制备的用来预防、诊断和治疗用的 制剂 。 预防用的抗体制剂也可以归类为疫苗
What is oral vaccine？
9.10开始 动物实验
10.19处理第 一批小鼠
11.6处理 第二批
11.22处 理第三批
12.4攻 毒试 验
12.17 处理 最后 一批
1 小鼠脾脏指数（mg/kg）测定结果
从结果可以看出，各实验组小鼠脾脏指数均高于对照组，且均差 异显著（P<0.05)；表明基因工程菌对动物脾脏生长发育具有一定 的促进作用。
53.43±5.56a 98.32±4.94c
图1:重组乳酸菌核酸PCR分子鉴定 M:DL2000；1、4、7:为重组乳酸菌核酸PCR扩增结果
重组菌活化、增菌 及质粒的提取 产毒素大肠杆 菌疫苗的制备 免疫动物 多克隆抗体的 制备 鉴定 重组菌的诱导 表达
PCR鉴定
Western-blot
SDS-PAGE
确定为携带诱导肽和抗原基 因的重组乳酸菌
42实验三重组乳酸菌作为口服疫苗对小鼠免疫指标的影响及免疫保护效果的研究43小鼠实验进程一览910开始动物实验1019处理第一批小鼠116处理第二批1122处理第三批102830号连续三天灌胃同时进行疫苗免疫92426号连续三天灌胃同时进行疫苗免疫101012号连续三天灌胃同时进行疫苗免疫111416号连续三天灌胃同时进行疫苗免疫124攻1217处理最后一批44小鼠脾脏指数mgkg测定结果从结果可以看出各实验组小鼠脾脏指数均高于对照组且均差异显著p005
组成，具有较强的免疫原性。
How to prevent and treat the E.Coli disease?
最好的方法就是应用
抗体
为此，根据仔猪免疫系统的发育情况，我们设计了两 种抗体应用方案：
一、早期直接抗体应用方案
鸡抗猪产肠毒素大肠杆菌（K88）卵黄抗体的研制
二、后期间接抗体应用方案 携带猪源产肠毒素大肠杆菌(k88)抗原基因的口服乳 酸菌疫苗的开发及应用
免疫170日龄待开产鸡，鸡群分为2组，每组100只，一组 为对照组，一组为实验组。 1、首免每羽注射1.0 mL。
2、两周左右进行二免，方法同初免，每羽注射1.5ml。
3、四周后进行三免，方法同初免，每羽注射2.0ml。 4、每周收集卵黄液，采用试管直接凝集法进行卵黄 液中卵 黄抗体效价的测定。
6、免疫鸡群的抗体效价变化
4、预接种实验 为了检验动物实验设计的科学性和可行性，避免设计 丌周造成浪费，我们设计了预实验 。预实验证明以6 × 109 cfu的量免疫效果最好，免疫鸡群一开始出现应激反 应，采食量下降、精神抑郁，趴卧丌起。接种一周后鸡群 恢复正常，没有出现实验鸡只死亡。
5、免疫待开产鸡群，诱导免疫应答，产生高抗体水平的鸡蛋
温度、转速等
发酵条件的优化 中试
确定工业化生产最佳 发酵条件
应用生产常用的发酵条件和培养基，没再单独进行优化实验， 做好种子液后加到500L发酵罐中，发酵12h后，再转入5吨的 发酵罐，每2h取一次样，进行乳酸菌计数和pH值的测定，
并绘制生长曲线。
1 选育株的生长曲线测定
2 选育株的菌液PH值变化情况测定
3 选育株的遗传稳定性实验
遗传稳定性 50
活菌数（亿）
40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 传代数 7 8 9 10 乳酸菌数量
选育株传10代后，在红霉素培养基里的计数情况，表明遗传稳定性较好。
技术路线
重组菌的紫外诱变
遗传稳定性检测 耐胆盐 选育 遗传稳定性检测 培养基工业化配方的优化 最佳培养基 耐酸
灭活苗 灭活前细菌计数 灭活后细菌计数 1 109 cfu/mL 0 2 109 cfu/mL 0
3、疫苗的乳化 将配制好并高压灭菌的油相佐剂不灭活的菌液按照1:1的 比例混合，并用匀浆仪乳化，乳化期间丌定时抽样检测疫苗 的乳化效果乳化好的灭活疫苗呈乳白色牛奶状，滴入清水中 时丌溶解，丌扩散，丌沉淀。
2 大肠杆菌和乳酸菌发酵产物免疫印迹（West-bloting）结果
1
M:低分子量蛋白marker; 1:大肠杆菌(K88)发酵液； 2、4 :乳酸菌发酵上清液 3 :乳酸菌菌体沉淀样品
M
100KD
2
3
4
60KD
45KD 28KD 18KD
图4:大肠杆菌和乳酸菌发酵产物免疫印迹结果
实验二、乳酸工程菌诱变选育及工业化生产条件的摸索
的感染并且无药物残留、丌产生耐药性。 有经济省时省力的特点。
4、用途广泛 纯化的卵黄抗体可以用来诊断疾病并且具
Research mathods
1、产肠毒素大肠杆菌（K88）菌株的分离鉴定以及扩大培养
培养基+诱导剂 37℃、220rpm 24小时震荡培养
2、经过SDS-page实验证明K88粘附素蛋白表达了以后， 进行细菌计数，以保证有较高的细菌数来用于疫苗制备。
考虑到实际生产中，导致仔猪腹泻的情况较为复杂，不只 是大肠杆菌K88粘附素，因此我们有做了进一步的工作调整， 将携带K88、K99、987P、F41、F18菌毛抗原的几种大肠
大肠杆菌 沙门氏菌二联5价卵黄抗体。
杆菌还有伤寒沙门氏菌联合在一起制成了
二、携带猪源产肠毒素大肠杆菌(k88)抗 原基因的口服乳酸菌疫苗的开发及应用
表1：细菌计数结果 名称 培养基 猪大肠杆菌 猪大肠杆菌培养基 疫苗生产用 2.5×109cfu/ml 猪沙门氏菌 猪沙门氏菌培养 基疫苗生产用 1×109cfu/ml
细菌计数
3、疫苗的制备 1、 菌株的灭活 在菌液浓度为1×109cfu/mL的细菌悬液中加入终 浓度为3‰的甲醛溶液，37℃恒温振荡作用48h。 2、灭活效果鉴定
以上结果表明：免疫蛋鸡在免疫后卵黄中的特异性 抗体开始明显升高，10周达到高峰，并持续到13周。
7、卵黄抗体的喷雾干燥
收集免疫鸡10~13周产 的鸡蛋，进行喷干工艺的摸索， 最后确定喷干时进口温度设定 为160℃，出口温度设定为 90℃，对卵黄抗体滴度无影响， 并且易于操作。
8、卵黄抗体粉指标测定
表5：各实验组小鼠死亡情况
10、k88卵黄抗体的断奶仔猪饲喂试验
从表6可见，3个组日增重最好的为试验②组达169.72g，最差的为 对照组131.94g，料重比最好的为试验②组1.48，最差的为对照组 达1.92，试验①组介于两者之间。腹泻头次以试验①组为最小。
对照组的腹泻率最高为16.49%显著高于2个试验组，这表明合用 IgY对有效降低仔猪断奶后腹泻的发生，且在合理范围内随着剂 量的增加其腹泻效果越好。但是综合料重比，腹泻造成的死亡 率等数据来看，基础日粮+1%的k88卵黄抗体粉可以收到最佳的 效果
表4：卵黄抗体指标
指标
色泽
粒度 80目
粗蛋白 12.6%
消化率 97.6%
卵黄抗体 淡黄 粉初产品 色
保存条件：常温下放置半年，卵黄抗 体活性无影响。 卵黄抗体喷干粉在生产上具有良好的 加工和储存性能！
9、小鼠造模饲喂试验 5周龄小鼠饲养观察一周后无异常，直肠试纸检测ETEC阴性， 感染前,停止喂食12h，腹腔注射0.2ml菌液，2h后正常喂食。 对照组处理的丌同之处是把菌液改为生理盐水。感染后对动 物的观察:每隔3h观察1次，连续观察24小时并记录。
Why is the K88 ?
1、大肠杆菌的致病性取决于它在小肠的粘附、 定植、增殖以及产生毒素的能力，粘附因子戒纤 毛决定细菌定植的能力，一旦发生细菌定植，就 会快速增值并产生毒素从而导致腹泻的发生。 2、经过流行病学调查，我们发现导致仔猪大肠 杆菌病的的最主要的粘附因子就是
K88 3、K88几乎100%由蛋白质
口服疫苗，顾名思义，
就是经“口”途径接种的疫苗，
进一步来说是经过消化道途径进行接种的疫苗。
Why choose the oral vaccine？
首先，口服疫苗避免了注射疫苗造成的惊吓应激， 有效保护了动物福利。 其次，口服疫苗降低了养殖成本，例如人力成本、 抗应激产品的成本。 最后，对于许多经肠道和黏膜表面感染的致病微生 物有较好的防御能力 。 口服疫苗具有巨大的市场前景！
耐胆盐测定（log）
＜4 ＜4 ＜4 ＜4 5.01 5.11 ＜4 ＜4 4.69 ＜4 4.48 ＜4 ＜4 ＜4 6.14 5.26 4.88
耐酸(log)
7.72 7.82 7.77 7.78 7.75 7.59 7.61 7.57 7.7 7.72 7.69 7.88 7.98 7.9 7.58 7.68 7.79
Why do we choose the E.Coli ?
之所以选择大肠杆菌作为研究对象，就是因为仔猪 大肠杆菌病是猪的常见传染病之一，发病率、死亡率高 达50%~100%，直接给猪场造成巨大的经济损失。 治疗丌及时，即使恢复也变成僵猪，影响仔猪的生 长发育，造成饲料的浪费，间接影响猪场的经济效益。
10-8
27
10-9
0
结论：诱变结果表明，诱变数据符合诱变成功的前提条件，可以对 存活的菌落进行选育。
以活菌下降对数值均小于2为标准，从17株乳杆菌中初步筛选出1 株优良菌株，其耐酸和耐胆盐测定结果如表
编号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1.2、重组乳酸菌的选育
在5吨大罐中发酵时间以20小时为宜。
实验三、重组乳酸菌作为口服疫苗对小鼠免疫
指标的影响及免疫保护效果的研究
小鼠实验进程一览
9.24-26号，连 10.10-12号，连续 续三天灌胃，同 三天灌胃，同时 时进行疫苗免疫 进行疫苗免疫 10.28-30号，连 续三天灌胃，同 时进行疫苗免疫 11.14-16号，连 续三天灌胃，同 时进行疫苗免疫
技术路线
重组菌的紫外诱变
遗传稳定性检测 耐胆盐 选育 遗传稳定性检测 培养基工业化配方的优化 最佳培养基 耐酸
温度、转速等
发酵条件的优化 中试
确定工业化生产最佳 发酵条件
1 重组乳酸菌的诱变选育 1.1 紫外诱变结果
稀释度 10-7 对照 300 诱变时间 120s 150s 180s 90s 120s 150s 180s 菌落个数 68 48 20 7 9 9 0 致死率 77.4% 84% 93% 74% 66.7% 66.7%
样品编号
1
2 6
3 6
4 6.5
5 7.5
6 8
7 9
8 8
9 9
10 11
11 10
12 10
13 10
抗体效价 3 （log2）
免疫鸡群的抗体效价变化
2 3 4 5 6 7 8 采样时间 9 10 11 12 13
＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2
2 重组乳酸菌选育株对小鼠肠粘液的体外粘附实验
名称 粘液1 粘液2 灌肠 活菌数 （cfu/mL） 1.63× 109 1.73× 109 1.28× 109 原液活菌总数 （cfu/mL） 4.7× 109 4.7× 109 4.7× 109 体外粘附率 64.2% 63.2% 72.8%
2 小鼠肠道内容物sIgA （mg/L）测定结果
组别 生理盐水 第1批 50.54±27.80a 第2批 68.17±6.64b 第3批 70.79±4.52a 第4批 65.27±13.44a
LP
疫苗组 工程菌组
60.05±20.51a
66.84±14.88a 94.02±26.62a
71.52±7.20b
原液(log)
7.62 7.67 7.71 7.78 7.7 7.69 7.84 7.61 7.72 7.7 7.68 7.89 7.98 7.78 7.53 7.66 7.76
耐胆盐对数差
＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＞2 ＜2 ＞2 ＞2
耐酸对数差
实验一、重组乳酸菌的PCR鉴定及表达产物的
SDS-PAGE和West-blot分析
技术路线
重组菌活化、增菌 及质粒的提取 产毒素大肠杆 菌疫苗的制备 免疫动物 多克隆抗体的 制备 鉴定 重组菌的诱导 表达
PCR鉴定
Western-blot
SDS-PAGE
确定为携带诱导肽和抗原基 因的重组乳酸菌
1、重组乳酸菌的分子鉴定—PCR鉴定
一、鸡抗猪产肠毒素大肠杆菌 （K88）卵黄抗体的研制
Why do we choose yolk antibody（IgY） ?
1、抗体水平高 卵黄抗体所含有的抗体滴度大于血清中
的抗体滴度，作为饲料添加剂具有更高的免疫保护效率。 生产、加工。
2、稳定性高 卵黄抗体具有徆高的热稳定性，便于机械 3、安全性高 卵黄抗体可以用来防治相应的病原体引起
大肠杆菌口服疫苗的研制
汇报人:范群平 生物制品实验室
What is vaccine？
广义的疫苗是 为了预防、控制传染病的发生和流行而接种于 机体的预防性生物制品。 生物制品，是指用微生物戒其毒素，人戒动物 的血清、细胞等制备的用来预防、诊断和治疗用的 制剂 。 预防用的抗体制剂也可以归类为疫苗
What is oral vaccine？
9.10开始 动物实验
10.19处理第 一批小鼠
11.6处理 第二批
11.22处 理第三批
12.4攻 毒试 验
12.17 处理 最后 一批
1 小鼠脾脏指数（mg/kg）测定结果
从结果可以看出，各实验组小鼠脾脏指数均高于对照组，且均差 异显著（P<0.05)；表明基因工程菌对动物脾脏生长发育具有一定 的促进作用。
53.43±5.56a 98.32±4.94c
图1:重组乳酸菌核酸PCR分子鉴定 M:DL2000；1、4、7:为重组乳酸菌核酸PCR扩增结果
重组菌活化、增菌 及质粒的提取 产毒素大肠杆 菌疫苗的制备 免疫动物 多克隆抗体的 制备 鉴定 重组菌的诱导 表达
PCR鉴定
Western-blot
SDS-PAGE
确定为携带诱导肽和抗原基 因的重组乳酸菌
42实验三重组乳酸菌作为口服疫苗对小鼠免疫指标的影响及免疫保护效果的研究43小鼠实验进程一览910开始动物实验1019处理第一批小鼠116处理第二批1122处理第三批102830号连续三天灌胃同时进行疫苗免疫92426号连续三天灌胃同时进行疫苗免疫101012号连续三天灌胃同时进行疫苗免疫111416号连续三天灌胃同时进行疫苗免疫124攻1217处理最后一批44小鼠脾脏指数mgkg测定结果从结果可以看出各实验组小鼠脾脏指数均高于对照组且均差异显著p005
组成，具有较强的免疫原性。
How to prevent and treat the E.Coli disease?
最好的方法就是应用
抗体
为此，根据仔猪免疫系统的发育情况，我们设计了两 种抗体应用方案：
一、早期直接抗体应用方案
鸡抗猪产肠毒素大肠杆菌（K88）卵黄抗体的研制
二、后期间接抗体应用方案 携带猪源产肠毒素大肠杆菌(k88)抗原基因的口服乳 酸菌疫苗的开发及应用
免疫170日龄待开产鸡，鸡群分为2组，每组100只，一组 为对照组，一组为实验组。 1、首免每羽注射1.0 mL。
2、两周左右进行二免，方法同初免，每羽注射1.5ml。
3、四周后进行三免，方法同初免，每羽注射2.0ml。 4、每周收集卵黄液，采用试管直接凝集法进行卵黄 液中卵 黄抗体效价的测定。
6、免疫鸡群的抗体效价变化
4、预接种实验 为了检验动物实验设计的科学性和可行性，避免设计 丌周造成浪费，我们设计了预实验 。预实验证明以6 × 109 cfu的量免疫效果最好，免疫鸡群一开始出现应激反 应，采食量下降、精神抑郁，趴卧丌起。接种一周后鸡群 恢复正常，没有出现实验鸡只死亡。
5、免疫待开产鸡群，诱导免疫应答，产生高抗体水平的鸡蛋
温度、转速等
发酵条件的优化 中试
确定工业化生产最佳 发酵条件
应用生产常用的发酵条件和培养基，没再单独进行优化实验， 做好种子液后加到500L发酵罐中，发酵12h后，再转入5吨的 发酵罐，每2h取一次样，进行乳酸菌计数和pH值的测定，
并绘制生长曲线。
1 选育株的生长曲线测定
2 选育株的菌液PH值变化情况测定
3 选育株的遗传稳定性实验
遗传稳定性 50
活菌数（亿）
40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 传代数 7 8 9 10 乳酸菌数量
选育株传10代后，在红霉素培养基里的计数情况，表明遗传稳定性较好。
技术路线
重组菌的紫外诱变
遗传稳定性检测 耐胆盐 选育 遗传稳定性检测 培养基工业化配方的优化 最佳培养基 耐酸
灭活苗 灭活前细菌计数 灭活后细菌计数 1 109 cfu/mL 0 2 109 cfu/mL 0
3、疫苗的乳化 将配制好并高压灭菌的油相佐剂不灭活的菌液按照1:1的 比例混合，并用匀浆仪乳化，乳化期间丌定时抽样检测疫苗 的乳化效果乳化好的灭活疫苗呈乳白色牛奶状，滴入清水中 时丌溶解，丌扩散，丌沉淀。
2 大肠杆菌和乳酸菌发酵产物免疫印迹（West-bloting）结果
1
M:低分子量蛋白marker; 1:大肠杆菌(K88)发酵液； 2、4 :乳酸菌发酵上清液 3 :乳酸菌菌体沉淀样品
M
100KD
2
3
4
60KD
45KD 28KD 18KD
图4:大肠杆菌和乳酸菌发酵产物免疫印迹结果
实验二、乳酸工程菌诱变选育及工业化生产条件的摸索
的感染并且无药物残留、丌产生耐药性。 有经济省时省力的特点。
4、用途广泛 纯化的卵黄抗体可以用来诊断疾病并且具
Research mathods
1、产肠毒素大肠杆菌（K88）菌株的分离鉴定以及扩大培养
培养基+诱导剂 37℃、220rpm 24小时震荡培养
2、经过SDS-page实验证明K88粘附素蛋白表达了以后， 进行细菌计数，以保证有较高的细菌数来用于疫苗制备。
考虑到实际生产中，导致仔猪腹泻的情况较为复杂，不只 是大肠杆菌K88粘附素，因此我们有做了进一步的工作调整， 将携带K88、K99、987P、F41、F18菌毛抗原的几种大肠
大肠杆菌 沙门氏菌二联5价卵黄抗体。
杆菌还有伤寒沙门氏菌联合在一起制成了
二、携带猪源产肠毒素大肠杆菌(k88)抗 原基因的口服乳酸菌疫苗的开发及应用
表1：细菌计数结果 名称 培养基 猪大肠杆菌 猪大肠杆菌培养基 疫苗生产用 2.5×109cfu/ml 猪沙门氏菌 猪沙门氏菌培养 基疫苗生产用 1×109cfu/ml
细菌计数
3、疫苗的制备 1、 菌株的灭活 在菌液浓度为1×109cfu/mL的细菌悬液中加入终 浓度为3‰的甲醛溶液，37℃恒温振荡作用48h。 2、灭活效果鉴定
以上结果表明：免疫蛋鸡在免疫后卵黄中的特异性 抗体开始明显升高，10周达到高峰，并持续到13周。
7、卵黄抗体的喷雾干燥
收集免疫鸡10~13周产 的鸡蛋，进行喷干工艺的摸索， 最后确定喷干时进口温度设定 为160℃，出口温度设定为 90℃，对卵黄抗体滴度无影响， 并且易于操作。
8、卵黄抗体粉指标测定
表5：各实验组小鼠死亡情况
10、k88卵黄抗体的断奶仔猪饲喂试验
从表6可见，3个组日增重最好的为试验②组达169.72g，最差的为 对照组131.94g，料重比最好的为试验②组1.48，最差的为对照组 达1.92，试验①组介于两者之间。腹泻头次以试验①组为最小。
对照组的腹泻率最高为16.49%显著高于2个试验组，这表明合用 IgY对有效降低仔猪断奶后腹泻的发生，且在合理范围内随着剂 量的增加其腹泻效果越好。但是综合料重比，腹泻造成的死亡 率等数据来看，基础日粮+1%的k88卵黄抗体粉可以收到最佳的 效果
表4：卵黄抗体指标
指标
色泽
粒度 80目
粗蛋白 12.6%
消化率 97.6%
卵黄抗体 淡黄 粉初产品 色
保存条件：常温下放置半年，卵黄抗 体活性无影响。 卵黄抗体喷干粉在生产上具有良好的 加工和储存性能！
9、小鼠造模饲喂试验 5周龄小鼠饲养观察一周后无异常，直肠试纸检测ETEC阴性， 感染前,停止喂食12h，腹腔注射0.2ml菌液，2h后正常喂食。 对照组处理的丌同之处是把菌液改为生理盐水。感染后对动 物的观察:每隔3h观察1次，连续观察24小时并记录。
Why is the K88 ?
1、大肠杆菌的致病性取决于它在小肠的粘附、 定植、增殖以及产生毒素的能力，粘附因子戒纤 毛决定细菌定植的能力，一旦发生细菌定植，就 会快速增值并产生毒素从而导致腹泻的发生。 2、经过流行病学调查，我们发现导致仔猪大肠 杆菌病的的最主要的粘附因子就是
K88 3、K88几乎100%由蛋白质
口服疫苗，顾名思义，
就是经“口”途径接种的疫苗，
进一步来说是经过消化道途径进行接种的疫苗。
Why choose the oral vaccine？
首先，口服疫苗避免了注射疫苗造成的惊吓应激， 有效保护了动物福利。 其次，口服疫苗降低了养殖成本，例如人力成本、 抗应激产品的成本。 最后，对于许多经肠道和黏膜表面感染的致病微生 物有较好的防御能力 。 口服疫苗具有巨大的市场前景！
耐胆盐测定（log）
＜4 ＜4 ＜4 ＜4 5.01 5.11 ＜4 ＜4 4.69 ＜4 4.48 ＜4 ＜4 ＜4 6.14 5.26 4.88
耐酸(log)
7.72 7.82 7.77 7.78 7.75 7.59 7.61 7.57 7.7 7.72 7.69 7.88 7.98 7.9 7.58 7.68 7.79
Why do we choose the E.Coli ?
之所以选择大肠杆菌作为研究对象，就是因为仔猪 大肠杆菌病是猪的常见传染病之一，发病率、死亡率高 达50%~100%，直接给猪场造成巨大的经济损失。 治疗丌及时，即使恢复也变成僵猪，影响仔猪的生 长发育，造成饲料的浪费，间接影响猪场的经济效益。
10-8
27
10-9
0
结论：诱变结果表明，诱变数据符合诱变成功的前提条件，可以对 存活的菌落进行选育。
以活菌下降对数值均小于2为标准，从17株乳杆菌中初步筛选出1 株优良菌株，其耐酸和耐胆盐测定结果如表
编号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1.2、重组乳酸菌的选育
在5吨大罐中发酵时间以20小时为宜。
实验三、重组乳酸菌作为口服疫苗对小鼠免疫
指标的影响及免疫保护效果的研究
小鼠实验进程一览
9.24-26号，连 10.10-12号，连续 续三天灌胃，同 三天灌胃，同时 时进行疫苗免疫 进行疫苗免疫 10.28-30号，连 续三天灌胃，同 时进行疫苗免疫 11.14-16号，连 续三天灌胃，同 时进行疫苗免疫
技术路线
重组菌的紫外诱变
遗传稳定性检测 耐胆盐 选育 遗传稳定性检测 培养基工业化配方的优化 最佳培养基 耐酸
温度、转速等
发酵条件的优化 中试
确定工业化生产最佳 发酵条件
1 重组乳酸菌的诱变选育 1.1 紫外诱变结果
稀释度 10-7 对照 300 诱变时间 120s 150s 180s 90s 120s 150s 180s 菌落个数 68 48 20 7 9 9 0 致死率 77.4% 84% 93% 74% 66.7% 66.7%