天根试剂盒法mRNA提取操作SOP

目的：
建立石蜡/新鲜组织总RNA提取操作规程。

范围：
适用石蜡/新鲜组织总RNA提取的操作。

职责：
研发实验室负责人负责维护本制度的适用性和执行有效性，并对RNA提取的质量进行监督。

内容：
1.1.实验前试剂材料准备与检查工作如下：
①RNA提取试剂盒（天根；常温放置）
②裂解液RL
③RNase-Free DNase I干粉(天根；保存
在2-8℃)
④无水乙醇；
⑤β-巯基乙醇
⑥RNase-free高压灭菌的1.5ml EP管；
⑦RNase-free高压灭菌的各类移液枪头；
⑧RNase-free水。

图1：天根提取试剂盒
1.2.操作步骤
第一部分:组织前处理：
1)石蜡组织前处理：
①取1ml二甲苯置于1.5ml EP管中，用管中二甲苯冲淋玻片，在湿润
时用刀片刮取石蜡组织至EP管中，共刮取4至8片石蜡玻片(或切取2-8片5-15 µm厚的石蜡切片)，不超过8片；
图2：石蜡玻片组织样本处理
图3：石蜡包埋组织样本处理
②震荡混匀器上强力振荡20s，18000rpm室温离心3min，用微量移液器
去除上清，小心不要移走沉淀的组织块(可以适情况重复上面步骤一次)；
③加1ml无水乙醇至EP管，震荡混匀后，18000rpm室温离心3min，移
除上清，小心不要移走沉淀的组织块；
④打开管盖，37℃挥发5-10min(或至酒精均已挥发无酒精味)；
2)新鲜组织前处理：
采用一次性的剪刀或刀片将新鲜组织块（10-20mg）在含有300μl裂解液RL（使用前检查是否加入1%的β-巯基乙醇）的灭菌1.5mLEP管中分割成小组织块（尽量减碎）。

第二部分：组织消化：
1)石蜡组织消化：加入200ul裂解液RF 以及10ul蛋白酶K 于沉淀中，彻底涡旋混匀；55℃孵育30～60 min 之后80℃孵育15 min。

O和10ul蛋白酶K于沉淀中，2)新鲜组织消化：加入590ulRNase-Free ddH
2
混匀后56℃处理60min。

图4：组织消化
第三部分：RNA吸附
1) 室温(20-25℃)，12,000 rpm(～13,400×g)离心5 min，转移上清入新的
RNase-free离心管中；
图5：转移上清
2)石蜡样本：加入220ul的缓冲液RB，涡旋混匀，加入660ul的无水乙醇；新
鲜组织：缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇。

图6：加入0.5倍上清体积无水乙醇
3)混匀（此时可能出现沉淀），转移700μl溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3
中（吸附柱放在收集管中），12,000 rpm(～13,400×g)离心30～60 sec，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；
图7：混合液转移
4)重复上一步骤，直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱CR3，弃废液，将
吸附柱CR3放回收集管中。

第四部分：DNase消化：
1)向吸附柱CR3中加入350ul去蛋白液RW1，12,000 rpm(13,400×g)离心
30-60s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

（对于新鲜组织，此步骤可以省去）；
图8：去蛋白液洗涤
2)DNase I储存液的配制：将DNase I干粉溶解在500ul RNase-free水中，
轻柔混匀，分装（50ul/管）后-20℃储存（可保存9个月），每次按照实验要求取出。

请注意将融化的DNase I的储存液置于4℃储存（可保周），请勿再次冻存；
图9：DNase储存液配制
3)DNase I工作液的配制：取50ulDNaseI储存液放入新的RNase-Free离心
管中，加入350 ulRDD溶液，轻柔混匀；
图10：DNase工作液配置
4)向吸附柱CR3 中央加入80ul的DNase I 工作液，室温放置15min；
图11：DNase室温消化15min
第五部分：RNA洗脱
1)向吸附柱CR3 中加入500ul去蛋白液RW1，室温(20~25℃)，12,000rpm(～
13,400×g)离心30-60s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
2)向吸附柱CR3 中加入500ul漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙
醇），室温静置2min，12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60s，弃废液，将
吸附柱CR3放回收集管中；
图12：漂洗液RW洗涤
3)重复上述步骤；
4)室温(20~25℃)，12,000 rpm(~13,400×g)离心2min，倒掉废液。

将吸附柱
CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

5)将吸附柱CR3 转入一个新的RNase-free 离心管中，向吸附膜的中间部位
悬空滴加30-100ulRNase-free ddH2O，室温放置2min，12,000 rpm(~13,400×g)离心2min，得到RNA 溶液。

6)在管壁和管盖上标清样本唯一性编号；
7)将RNA用于后续操作或冻存在-80℃；
8)及时做好纸质和电子文档记录。

第六部分 RNA质量检测
1)完整性：琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。

由于固定和包埋的条件限
制，FFPE样本核酸通常发生片段化并且会被甲醛化学修饰，因此较难提取，本试剂盒提取的RNA可应用于RT-PCR等下游试验。

图13：漂洗液RW洗涤
该试剂盒能可从新鲜组织中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。

提取的总RNA纯度极高，没有蛋白质和其他杂质污染。

例如利用该试剂盒分离大鼠不同组织总RNA，琼脂糖凝胶电泳结果显示，在7~15kb处，高分子RNA （mRNA和 hnRNA）呈不连续的带状分布，在5kb（28S）和2kb（18S）有两条主要条带。

2)纯度分析：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。

高质量的
RNA，OD260/OD280 读数在1.8-2.1 之间，比值为2.0 是高质量RNA 的标志。

OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。

同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。