基于代谢组学的小儿腺病毒肺炎痰热闭肺证生物标志物研究思路＊

基于代谢组学的小儿腺病毒肺炎痰热闭肺证生物标志物研究思
路＊
王昕泰;杜丽娜;汪受传
【摘要】Study on the scientific essence of traditional Chinese medicine (TCM) syndrome is the key in TCM modernization. This paper showed new research ideas for TCM syndrome, which was based on the pediatric adenovirus pneumonia and its TCM treatment, metabonomics and its application in TCM syndrome research, in order to discuss its application value in the diagnosis and treatment of pediatric viral pneumonia. This method was mainly implemented through the metabonomics technology, which reflected TCM holism concept. The syndrome of phlegm-heat obstructing the lung, which was the most frequent syndrome in the pediatric viral pneumonia, was studied. Through the comparison with metabolites of healthy children, the biomarkers of syndrome of phlegm-heat obstructing the lung in pediatric viral pneumonia were identified.%中医证候的科学实质研究是中医现代化的关键，本文尝试阐述一种中医证候基础研究的初步思路，即通过考查现有的小儿腺病毒肺炎及其中医药治疗现状、代谢组学及其在中医证候的应用现状，探讨其在小儿病毒性肺炎诊疗规范中的应用价值。

该方法主要通过能体现中医学“整体观念”的代谢组学作为技术手段，研究小儿病毒性肺炎中最常见的痰热闭肺证；并通过与健康儿童的代谢物质进行比较，确认小儿病毒性肺炎之痰热闭肺证的生物标志物。

【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》
【年(卷),期】2015(000)010
【总页数】4页(P2177-2180)
【关键词】腺病毒肺炎;痰热闭肺;证候;代谢组学;生物标志物
【作者】王昕泰;杜丽娜;汪受传
【作者单位】南京中医药大学中医儿科学研究所南京 210023; 江苏省儿童呼吸疾病中医药重点实验室南京 210023;南京中医药大学中医儿科学研究所南京210023; 江苏省儿童呼吸疾病中医药重点实验室南京 210023;南京中医药大学中医儿科学研究所南京 210023; 江苏省儿童呼吸疾病中医药重点实验室南京210023
【正文语种】中文
【中图分类】R246.4
小儿病毒性肺炎的中医证候规范分型目前已经得到国内同行普遍认可[1]。

腺病毒
肺炎作为小儿病毒性肺炎的一种，具有致死率高、症状重、易合并多脏器功能衰竭等特点，已经成为近年来的研究热点。

中医辨证论治的特点，尤其在治疗小儿病毒性肺炎方面具有明显优势[2]。

证候作为辨证论治的基础，是中医学诊断、治疗的
关键，但应用现代科技术语表述证候实质上却一直是个难点。

目前研究认为，证候实质研究可以通过将体现生物体整体功能水平的代谢组学与中医整体思想相契合来直观反映。

本课题组拟采用代谢组学技术研究小儿腺病毒肺炎之痰热闭肺证的证候学实质，试述相关研究思路如下。

腺病毒为DNA病毒，有较强的耐酸、耐温、耐脂溶剂能力，腺病毒肺炎的基本病理为坏死性毛细支气管炎、坏死性的肺浸润，坏死性的小气道上皮和黏膜下纤维化，
瘢痕的形成导致细支气管腔向心性狭窄和破坏，可见黏液栓、慢性炎症。

纤维化组织部分或完全阻塞细支气管或肺泡小管[3]。

腺病毒感染典型特征为多发性综合征、上呼吸道感染、结膜炎、肺炎、腹泻（肠道感染），治疗上与呼吸道合胞病病毒感染不同，腺病毒感染目前西药尚无确定有效的治疗药物，仅对于重症患者可以“尝试使用静脉免疫球蛋白（IVIG）”[4]，但其疗效尚未见规范化的临床研究报道。

代谢组学具有动态性和多参数应答性，它反映了在基因、生活环境、时间和季节、气候、感染、疾病、药物、食物等先天、后天多重因素的综合作用下，机体内小分子物质的总体状态，是多种因素的合集。

代谢组学分析方法所需样本量极少，检测仅需要微升级的数量即可，尿液、痰液、粪便、血浆等样本容易获得且对人体基本无损伤或仅有极小损伤[5]，同时其检测灵敏度极高[6]，可以反映蛋白和基因表达极微小的变化。

由于代谢物组是生物体所有基因、蛋白功能活动的终点，因而被视为生物体整体功能状态的“生化表型”，能即时、灵敏、真实表现在各种外界因素刺激下生物体整体功能状态的应答与调节。

代谢组学并不关注生物的调控过程，直接分析代谢物，研究过程中不需要进行全基因组测序或建立表现基因序列标签的庞大数据库[7]。

与其他组学相比，更能体现中医学的“整体观念”[8]，比传统方法更加适用于研究儿童疾病的诊断。

中医药治疗病毒性肺炎，副作用小，疗效好，后遗症少[9]，在腺病毒肺炎的不同
阶段均有明确有效的方药，如早期以宣肺清热解毒为主，中期加用涤痰豁痰，重症极期扶正救逆，常用银翘散、杏苏散、麻杏石甘汤、小青龙汤等方药[10]。

研究发现临床中用来治疗小儿肺炎痰热闭肺证的中药可以下调腺病毒感染的人胚肺成纤维细胞的转化生长因子（Transforming Growth Factor-β，TGF-β1）的mRNA表达，这说明了中药抗病毒的部分作用机制[11]。

在证候研究方面，南京中医药大学附属医院等四中心480例病毒肺性炎住院患者研究证实，其中痰热闭肺证占比最
高为75%[12]。

基于临床实际情况出发，本研究拟从占比例最大的痰热闭肺证入
手展开研究。

已经有相当多的研究证实，在病毒感染性疾病过程中，生物体的代谢会发生相应改变。

如Lu等[13]研究发现H1N1流感病毒感染肺炎患者体内多种代谢途径发生改变，如花生四烯酸、亚麻酸、谷胱甘肽、嘧啶、嘌呤等代谢，其中以花生四烯酸代谢通路中的内源性物质改变最显著。

Numata等[14]发现磷脂酰甘油（Phosphatidylglycerol，PG）能抑制流感病毒复制并降低病毒附着质模的能力，明显减弱炎性细胞浸润的发展。

用代谢组学研究中医证候目前也取得了初步成果：仇盛蕾[15]研究发现冠心病心力衰竭患者的低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、脂类、不饱和脂肪酸等发生明显改变。

林燕[16]研究证实肺卫气虚证候的代谢标志物为半胱氨酸、L-蛋氨酸、苏氨酸、焦谷氨酸等氨基酸代谢的紊乱，并且会随着季节变化而发生标志物的变化，初步证实了同一证候不同时间的生物标志物不同。

毕建璐[17]研究发现气虚质的代谢紊乱表现在尿液中肌酸酐、组胺、葡萄糖、丙氨酸、鸟苷、三磷酸甘油酸、磷酸肌酸、马尿酸、组氨酸、甘油酸等物质的水平显著升高，这些代谢产物与三羧酸循环、糖酵解、氨基酸代谢、脂肪酸代谢等多个能量代谢通路相关。

戴继灿[18]发现肾阳虚型的主要变化集中在有机酸及脂类代谢通路的异常。

本实验室前期研究也证实，RSV感染小鼠与正常小鼠相比其代谢网络发生明显变化，其中以脂肪酸的代谢最为明显。

张杰等[19]提出：“只要比较某方剂在治疗相应证候前后机体各组织脏器代谢组学的图谱，找出发生变化的那些物质，便可视其为该证候的物质基础”。

与之不同的是本试验不从药物治疗入手，而是从对比健康儿童的生物样本和腺病毒肺炎痰热闭肺证患儿样本的代谢图谱入手，找出两组间固定的、规律的、明显不同的物质群，进而找到痰热闭肺证的生物标志物。

由此，可以导向新型抗病毒药物的研发，甚至分子靶向药物的研发，指导其他中医证候的研究，同时为疾病的早期诊断[20]和中医诊断的标准化提供依据。

本实验室已采集正常儿童尿液进行试测，对尿液样本的处理方法已熟练掌握，已建立LC-MS检测尿
样的方法，对部分峰进行解析（图1）。

鉴于代谢组学与中医学的整体观念和证候学说相吻合，我们拟将代谢组学技术引入小儿病毒性肺炎中医证候生物标志物研究，以临床实际为基础，以代谢组学技术为研究手段，进行初步探讨。

具体方法设计如下:以小儿腺病毒肺炎痰热闭肺证为研
究目标，收集30-40例患儿的临床样本，采集患儿血液、尿液，同时收集30-40
例健康同龄儿童血液和尿液。

样本处理并优化色谱条件后进行血液、尿液中的全成分分析，采用液质联用方法获取代谢物指纹谱；以多变量模式识别技术进行数据分析，提取代谢图谱中提供的化学信息，运用多种数据处理技术，获取血、尿代谢物复杂组分中的与证候相关的代谢谱群，建立腺病毒肺炎痰热闭肺证数据库。

然后
与健康儿童数据相比对，结合已颁布实施的中医诊疗指南[1]，对腺病毒肺炎痰热
闭肺证进行研究，确认痰热闭肺证的标志性代谢物，从而确认该证型的生物标志物。

当然，代谢组学在中医研究中的应用还处于起步阶段，许多技术问题还在不断的探索之中，比如生物样本处理方法的不同对于代谢谱的影响、不同的气相色谱和液相色谱及后级串联质谱的不同对代谢物组的影响、不同的数据分析方法导致代谢特征物质的不同等等问题均需要在进一步的试验研究中一一加以确认，并争取建立相关的试验操作标准、液相、气相及质谱条件标准和数据分析等技术标准，为其他中医疾病的证候研究提供参考，为揭示中医学整体变化规律的本质提供理论基础。

目前，代谢组学已经被广泛应用在中医证候实质、中医体质、中药药性、药理、药代动力学等方面的研究，部分研究已经取得了初步成果。

可以预期，在与中医基本思维模式保持一致的优势下，代谢组学必将会成为中医现代化研究一个新的起飞点。

参考文献
【相关文献】
1 汪受传,陈争光,徐珊.小儿病毒性肺炎中医诊疗指南.南京中医药大学学报, 2011, 27(4): 304-308.
2 汪受传,韩新民,任现志,等.中医药治疗小儿病毒性肺炎评价指标体系的研究.中医儿科杂志, 2007, 3(3): 9-12.
3 Mauad T, Dolhnikoff M. Histology of childhood bronchiolitis obliterans.Pediatric Pulmonology, 2002, 33(6): 466-474.
4 Hay W, Abzug M, Myron L,et al. Current Diagnosis and Treatment Pediatrics,Twenty-First Edition.New York:McGraw-Hill Professional, 2012: 1051-1054.
5 王献,林树海,蔡宗苇.基于质谱技术的代谢组学研究及其在中国的发展.中国科学:化学, 2014,
44(5): 724-731.
6 Avern a T A, Kline E E, Smith A Y,et al. A decrease in 1H nuclear magnetic resonance spectroscopically determined citrate in human seminal fluid accompanies the development of prostate adenocarcinoma.J Urol, 2005, 173(2): 433-438.
7 Taylor J, King R D, Altmann T,et al. Application of metabolomics to plant genotype discrimina tion using statistics and machine learning.Bi oinformatics, 2002, 18( Suppl 2): S241-S248.
8 汪受传,杜丽娜,单进军,等.应用代谢组学探讨小儿病毒性肺炎中医证候标准化的研究思路.中医儿科杂志, 2013, 9(1): 1-3.
9 汪受传,韩新民,任现志,等.小儿病毒性肺炎痰热闭肺证治疗方法研究.南京中医药大学学报(自然科学版), 2004, 20(2): 72-75.
10 胡亚美,江载芳.诸福棠实用儿科学(第7版).北京:人民卫生出版社, 2002: 1191-1195.
11 汪受传,王文革,陈四文,等.清肺口服液对3I、7b型腺病毒感染人胚肺成纤维细胞TGF-β1 mRNA 基因表达的影响.世界科学技术-中医药现代化, 2005, 7(3): 34-37.
12 汪受传,韩新民,任现志,等.小儿病毒性肺炎480例中医证候学特点研究.南京中医药大学学报(自然科学版), 2007, 23(1): 14-19.
13 Lu C, Jiang Z, Fan X,et al. A metabonomic approach to the effect evaluation of treatment in patients infected with influenza A (H1N1).Talanta, 2012, 100(10): 51-56.
14 Numata M, Kandasamy P, Nagashima Y,et al. Phosphatidylglycerol Suppresses Influenza A Virus Infection.Am J Resp Cell Mol, 2012, 46(4): 479-487.
15 仇盛蕾.心衰合剂对冠心病心力衰竭患者代谢组学及生存质量的影响.北京:北京中医药大学博士学位论文, 2014: 6-8.
16 林燕.基于代谢组学的肺卫气虚证候变化规律及中药复方干预的临床研究.石家庄:河北医科大学博士学位论文, 2014: 45-48.
17 毕建璐.补中益气丸干预气虚质的临床观察及其血浆代谢组学机制研究.广州:南方医科大学博士学位论文, 2014: 50-52.
18 戴继灿.男性不育证候、用药规律及其肾阳虚型的代谢组学特征研究.北京:北京中医药大学博士学位论文, 2014: 53-55.
19 张杰,李涢.关于中医证候物质基础研究路径的思考.中国中医基础医学杂志, 2007, 13(5): 394-
395.
20 Wang-Sattler R, Yu Z, Herder C,et al. Novel biomarkers for prediabetes identified by metabolomics.Mol Syst Biol, 2012, 8(1): 615.。