白菜型冬油菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的克隆、表达及其活性分析

白菜型冬油菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的克隆、表达及
其活性分析
曾秀存;孙万仓;方彦;刘自刚;董云;孙佳;武军艳;张鹏飞;史鹏辉
【摘要】抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种在逆境条件下清除细胞内氧自由基、增强植物抗逆性的关键酶.本研究根据已发表植物抗坏血酸过氧化物酶基因APX的同源保守序列设计引物,采用RT-PCR扩增超强抗寒白菜型冬油菜陇油7号的DNA,获得APX基因开放阅读框,长度为753 bp,编码250个氨基酸残基,推导的氨基酸序列具有APX蛋白的典型特征.生物信息学分析显示,与已报道的大白菜的APX氨基酸序列同源性达99％,该酶蛋白具有高度的进化保守性,其保守序列属于植物的POD超家族,APX相对分子质量和理论等电点依次为27.7 kD和5.58; APX基因无信号肽,是一个亲水性蛋白,可推测其定位于细胞质中;二级结构预测表明陇油7号的APX是由不规则卷曲和α-螺旋组成的稳定蛋白.实时荧光定量PCR和酶活性分析显示,该基因表达和酶活性受低温胁迫诱导,表明该基因在白菜型冬油菜陇油7号适应低温胁迫过程中发挥重要作用.
【期刊名称】《作物学报》
【年(卷),期】2013(039)008
【总页数】9页(P1400-1408)
【关键词】白菜型油菜;低温;APX基因克隆;表达分析;APX活性
【作者】曾秀存;孙万仓;方彦;刘自刚;董云;孙佳;武军艳;张鹏飞;史鹏辉
【作者单位】甘肃农业大学农学院,甘肃兰州 730070;河西学院农业与生物技术学院,甘肃张掖 734000;甘肃农业大学农学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学农学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学农学院,甘肃兰州 730070;甘肃省农业科学院作物研究所,甘肃兰州 730070;Department of Plant Sciences,University of Saskatchewan,Saskatoon,Saskatchewan,S7N5A8,Canada;甘肃农业大学农学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学农学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学农学院,甘肃兰州 730070
【正文语种】中文
干旱和低温等环境胁迫严重影响植物的正常生长发育, 使细胞代谢不协调, 产生大量伤害自身的活性氧, 引起膜脂过氧化、膜蛋白聚合等反应, 从而破坏生物膜的结构和功能, 损伤植物细胞[1-2]。

H2O2是一种主要的活性氧, 及时清除H2O2对于维持植物细胞正常的生理功能非常重要。

抗坏血酸过氧化物酶(APX)就是植物进化出来的一种清除植物叶绿体和胞质中 H2O2的抗坏血酸-谷胱甘肽循环机制的关键酶[3-4], 它利用抗坏血酸作为电子供体清除植物体内产生的 H2O2 [5-6], 从而提高植物抵御氧化胁迫能力, 增强植物的抗逆性。

盐地碱蓬[7]、白桦[8]、黑麦草[9]、番茄[10]等植物的研究已证实APX基因在抗氧化胁迫中的重要作用。

目前, 已有许多植物的 APX基因被克隆, 但用于APX基因克隆和功能研究的植物大都是正常环境下生长的模式材料, 而对于能在北方寒区安全越冬的白菜型冬油菜 APX基因的克隆、生物信息学分析及低温胁迫下基因的表达研究报道较少。

冬油菜种植北移可使其成为北方寒区一种重要的生态作物和油料作物, 但北方寒区冬季酷寒, 多风干旱, 极端低温导致植物体内过量 H2O2活性氧积累, 使其不能安全越冬。

因此, 利用现代生物技术发掘北方寒区冬油菜的抗寒基因, 开展抗寒转基因育种具有非常重要
的意义。

基于APX能及时清除 H2O2, 使植物在一定程度上忍耐、减缓或抵抗低温胁迫[11-12], 本研究克隆了超强抗寒冬油菜陇油 7号的 APX基因, 测定该基因在组织中表达, 比较陇油 7号和天油 4号在不同低温胁迫下叶片和根部APX活性, 以期明确白菜型冬油菜在越冬过程中抵御低温胁迫的机制和APX基因的抗寒功能, 为北方寒区冬油菜分子抗寒育种提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 供试材料
超强抗寒白菜型冬油菜品种陇油7号和抗寒性较弱的白菜型冬油菜品种天油 4号, 均由甘肃农业大学农学院作物遗传育种系提供。

选取饱满、大小一致的油菜种子, 用0.1% (V/V)氯化汞消毒10 min,蒸馏水冲洗 3次后, 播于铺两层滤纸的培养皿, 置恒温培养箱(24±1)℃催芽, 待胚根露白后播至装有育苗基质的营养钵(上口径10 cm, 下口径7 cm, 高10 cm)内, 培养幼苗至六叶期, 备用。

1.2 总RNA的提取及反转录
按照TRIzol试剂的用户手册提取陇油7号幼苗的叶片总RNA, 电泳检测后, 按照M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒(BS249)的说明得到单链 cDNA,置–20℃冰箱保存, 备用。

1.3 引物设计与APX基因克隆
根据GenBank数据库中已报道的大白菜APX基因(GenBank登录号为
GQ500125)的核苷酸序列设计引物: Apx-F (5′-GGATCCATGACGAAGAACTAC-3′),Apx-R (5′-CTTAAGAGCATCAGCAAACCC-3′)。

以陇油 7号油菜幼嫩叶片的反转录 cDNA为模板, 用引物Apx-F和Apx-R进行扩增。

扩增产物经生工生物工程(上海)股份有限公司的普通琼脂糖凝胶 DNA纯化回收试剂盒(生工 SK1141)回收, 并与 pUCm-T载体连接, 反应体系与反应条件为 10倍的连接液1 μL, pUCm-T Vector 1 μL, T4 连接酶1 μL, 回收DNA 2 μL, 将混合反应液置16~23℃连接
1~2 h。

将连接后的质粒转化到大肠杆菌感受态细胞, 过夜培养, 蓝白斑筛选后挑取白斑, 经含有氨苄青霉素的液体培养基振荡培养12 h后, 以PCR检测菌落, 将阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.4 APX预测蛋白的生物信息学分析
将获得的APX基因在NCBI网站上Blast比对,用ORF Finder寻找开放阅读框, 并对F-box区域进行分析; 利用DNAStar软件进行多重序列比较和氨基酸同源性分析, 产生的多重比对结果通过 MEGA 4.0软件构建系统发生树; 利用
http://www.expasy.ch/tools/protparam.html网站分析来源于 NCBI中已注册的大白菜 APX (登录号为 ACV92696.1)、甘蓝型油菜APX (登录号为
CAA72247.1)、甘蓝BO-APX1(登录号为BAB84008.1)、芥菜型油菜APX (登录号为 AAN60795.1)、拟南芥 APX1 (登录号为AEE28205.1)以及本研究克隆的APX蛋白质的各种理化性质; 利用在线工具TMHMM和 SignalP分析蛋白跨膜结构域和预测信号肽; 利用 ExPASy工具中的SOPMA软件预测蛋白质二级结构。

1.5 白菜型冬油菜 APX基因在低温胁迫下的表达量
选取生长健壮、六叶期的陇油7号和天油4号植株, 于4℃培养8 d后保存于液氮, 继而转入超低温培养箱在–4℃处理3 d, 取叶片和根备用, 最后将植株置–8℃培养3 d, 取叶片和根, 冷冻保存, 备用。

以未低温处理的植株为对照(CK)。

用低温处理以及对照叶片和根部提取RNA。

根据扩增所获得的基因序列设计特异引物AR (5'-GGAGCAGTTCCCTACC ATC-3')和AF (5'-CACCAGACAAAGCGACAAT-3'),选取 Actin基因作为内参基因(正向引物 Act-R:5'-TTCTTACCCTCAAGTATCCG-3'; 反向引物Act-F: 5'-TCACCAGAGTCGAGCACA-3')。

参考Green-2-GoqpcR Mastermix-LowRox (2x) (上海生物工程有限公司)试剂盒说明书, 采用两步法进行Real-time PCR扩增, 扩增程序为预变性95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 40个循环, 每个cDNA样品重复3次。

根据得到的Ct值, 利用Kenneth和
Thomas报道的 2–ΔΔCt方法[13]分别计算出不同温度处理下陇油7号和天油4号叶片和根部APX基因的表达量, 绘出折线图。

图1 白菜型油菜APX基因的RT-PCRFig. 1 RT-PCR results of APX gene in winter turnip rape M: DL2000 marker; 1: APX基因扩增结果。

M: DL2000 marker; 1: PCR product of APX gene.
图2 菌液PCR的电泳结果Fig. 2 Electrophoresis results of PCR M: DL2000 marker; 1~6: 菌液PCR产物。

M: DL2000 marker; 1–6: PCR products.
1.6 抗坏血酸过氧化物酶活性测定
于2010年8月20日播种陇油7号和天油4号于甘肃省永登县秦王川甘肃农业大学试验基地, 待幼苗长至五叶期, 分别于10月8日(气温14~20℃)、10 月 17日(气温8~17℃)、10 月 31日(气温–2~12℃)、11 月 15 日(气温–10 ~ –4℃)、2011 年 1 月 18 日(气温–20~ –8℃)取样。

参照邹琦[14]的方法测定APX活性。

3 mL反应混合液中含 50 mmol L–1 K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH 7.0)、0.1 mmol L–1 EDTA-2Na、0.3 mmol L–1抗坏血酸(AsA)、0.06 mmol L–1 H2O2和APX酶液0.1 mL。

加入H2O2后立即在20℃下测定10~30 s内OD290值变化, 计算单位时间AsA减少量即APX活性。

2 结果与分析
2.1 APX基因克隆
以大白菜 APX基因序列为参考, 紧邻其起始密码和终止密码设计引物, 以陇油7号cDNA第一链为模板, 进行RT-PCR扩增, 得到约750 bp片段(图1), 回收纯化片段, 连接到T载体后转化和利用菌液PCR筛选阳性克隆(图2)。

从图2可以看出, 随机挑取的6个克隆中的4个在750 bp左右出现目的片段, 说明克隆的APX基因已插入载体中。

将阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序, 得到 762 bp cDNA 序列(图 3)。

测序结果经 NCBI的 Blast程序检索数据库分析显示, 该序
列与大白菜和甘蓝同源基因具有高达99%以上的同源性, 认为所获得的序列为白菜型冬油菜 APX基因保守区序列。

2.2 白菜型油菜 APX基因cDNA序列分析及结构功能预测
白菜型冬油菜APX基因的cDNA序列含有一个长度为753 bp的完整开放ORF, 编码含250个氨基酸的蛋白质(图4)。

利用Protparam预测APX基因编码蛋白质的理化性质, 结果表明(表1)白菜型油菜品种陇油 7号APX基因蛋白相对分子质量约27.7 kD, 含有Leu、Ala、Gly、Glu、Pro、Arg、Asp等含量丰富的氨基酸, 其中以Leu所占比例最高, 达到10.8%。

预测不稳定指数为38.82, 属于稳定蛋白。

总平均疏水指数为–0.405, 等电点为5.58, 其氨基酸残基数、分子量和理化性质与大白菜几乎一致, 而与甘蓝型油菜、甘蓝和芥菜型油菜以及拟南芥略有差异。

利用在线工具TMHMM和SignalP 3.0对陇油7号APX基因的N端前70个氨基酸序列进行信号肽预测, 结果表明陇油7号APX基因的N端不存在任何信号序列, 是非分泌性蛋白(图 5), 推测其定位于细胞质中。

进一步采用ProtScale分析其疏水性, 结果显示, 陇油7号APX基因的N端氨基酸基本以亲水氨基酸为主, 进一步证实其 N端不存在信号肽序列。

与前述SignalP 3.0软件预测的结果一致。

疏水性预测结果表明, 其亲水性/疏水性的最大值是位于氨基酸残基序列第103位的Val, 其分值为2.256, 而位于第 120位的 Glu分值最低, 为–2.856, 这与亲水性/疏水性的图形一致(图6)。

根据氨基酸分值越低亲水性越强, 分值越高疏水性越强的规律, 在整个肽链中亲水性氨基酸残基的数量要多于疏水性氨基酸残基, 因此, 推测白菜型冬油菜品种陇油 7号的 APX蛋白为亲水性蛋白。

图3 APX基因的编码区核酸序列及推导氨基酸序列Fig. 3 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of APX gene方框为起始密码子ATG; *为终止密码子TAA。

ATG is indicated in box; TAA is marked by asterisk.
图4 白菜型冬油菜APX的ORFFig. 4 Open reading frame of APX gene in winter turnip rape
用在线工具SOPMA预测, 白菜型冬油菜品种陇油7号APX蛋白的二级结构由α-螺旋(alpha helix)、无规则卷曲(random coil)、延伸链(extended strand)以及β-转角(beta turn)组成, 4种二级结构元件所占比例分别为40.40%、40.40%、11.20%和8.00% (图7)。

用NCBI在线CDS程序分析发现APX基因编码蛋白含有保守序列, 属于植物的POD超家族, 同时在CCD数据库中比对发现该蛋白含3个结合位点即亚铁血红素结合位点、底物结合位点和K+阳离子结合位点以及1个由第4~247位共244个氨基酸组成的抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase)保守结构域(图 8)。

相似性比较发现 APX蛋白与大白菜、甘蓝、萝卜、芥菜和拟南芥的同源蛋白具有很高的一致性,达到91%~99% (图9), 这暗示该蛋白为白菜型冬油菜中的APX同源蛋白。

进一步分析甘蓝型油菜APX蛋白与其他植物 APX蛋白亲缘关系, 将同源蛋白进行系统发生分析。

如图10所示陇油7号APX基因的蛋白与大白菜(B. rapa subsp. pekinensis)、甘蓝(B. oleracea var. italica)、萝卜(Raphanus sativus)和芥菜(B. juncea)属于同一亚族, 亲缘关系更近, 而与胡黄连(Picrorhiza kurrooa)、地黄(Rehmannia glutinosa)和高粱(Sorghum bicolor)的亲缘关系相对较远。

表1 十字花科植物APX 基因编码蛋白质预测的理化性质Table 1 Physico-chemical properities of APX cDNA and their amino acid sequences of several rape plants十字花科植物Some plants in mustard family氨基酸残基Number of amino acids相对分子质量Molecular weight (kD)理论等电点pI Theoretical isoelectric point蛋白质不稳定指数Protein instability平均疏水指数(GRAVY)Grand average of hydropathicity氨基酸组成种类Types of amino acid含量最丰富的氨基酸The most abundant amino acids (%)白菜型冬油菜
Winter turnip rape 250 27.65 5.58 38.82 –0.405 20 Leu 10.8, Ala 10.0, Gly 8.4大白菜Chinese cabbage 250 27.68 5.58 39.80 –0.408 20 Leu10.8, Ala 10.0, Gly 8.4甘蓝型油菜Brassica napus 250 27.64 5.70 41.92 –0.315 20 Leu 10.8, Ala 10.8, Gly 8.0甘蓝Cabbage 250 27.68 5.58 37.51 –0.398 20 Leu 10.4, Ala 10.0, Gly 8.4芥菜型油菜Brassica juncea 250 27.56 5.63 27.18 –0.230 20 Leu 11.2, Ala 10.4, Gly 8.0拟南芥Arabidopsis thalian 250 27.56 5.72 33.87 –0.385 20 Leu 9.2, Ala 10.4,Gly 8.4, Asp 8.4
图5 以Signal P 3.0程序预测白菜型冬油菜APX信号肽Fig. 5 Predicted signal peptide by Signal P 3.0
图6 ProtScale程序预测白菜型冬油菜APX的疏水性Fig. 6 Hydrophobicity of APX predicted by ProtScale
图7 预测白菜型冬油菜APX蛋白质的二级结构Fig. 7 Predicted second structure of APX in winter turnip rape蓝色: α螺旋; 紫色: 无规则卷曲; 红色: 延伸链; 绿色: β转角。

Blue: alpha helix; Purple: random coil; Red: extended strand; Green: beta turn.
图8 白菜型冬油菜APX结构域预测分析Fig. 8 Predication of domains of APX protein in winter turnip rape
图9 白菜型冬油菜APX蛋白与其他植物APX蛋白氨基酸的多重比较Fig. 9 Sequence multi-alignment of the deduced APX protein of winter rape with other species
图10 陇油7号APX蛋白与其他相关蛋白序列的系统进化树分析Fig. 10 Phylogenetic analysis of Longyou 7 APX proteins with other related proteins
2.3 白菜型冬油菜APX基因表达的定量分析
实时荧光定量PCR分析表明(图11和图12), 低温胁迫下两品种的APX基因表达量均较正常温度下增加, 随着处理温度的降低, 均呈“上升-下降-上升”的趋势, 陇油7号APX基因表达量在4℃、–4℃和–8℃较对照分别增加 26.9、17.2和 37.9倍, 而天油 4号相应只增加11.5、5.7和16.3倍; 根部APX基因表达呈先上升后下降的趋势, 陇油 7号和天油 4号在–4℃表达量达最大, 分别为对照的38.7倍和20.4倍, 在–8℃时, 表达量下降, 分别为对照的 16.5倍和9.7倍; 在同一低温下, 陇油7号叶片和根部APX表达量均明显高于天油4号, 这与其大田表现一致。

图11 低温胁迫下白菜型冬油菜叶和根中APX基因的实时荧光定量PCR分析Fig.
11 RT-PCR analysis of APX gene in leaves and roots of winter turnip rape under low temperature
图12 低温胁迫下白菜型冬油菜叶片及根部APX基因的相对表达量Fig. 12 Relative expression of APX gene in leaves and roots of winter turnip rape under low temperature
图13 APX活性变化Fig. 13 Effects of low temperature stress on APX activity of winter rape
2.4 冬油菜两品种APX活性的比较
由图 13所示, 随着取样时间的延迟(即温度的降低) , 陇油7号和天油4号根部的APX活性呈先上升后下降的趋势, 10月 31日根部的酶活性最高,分别为10月8日样品的2.33倍和1.41倍。

说明10月 31日的低温(气温–2~12℃)是冬油菜耐受力的一个转折点, 而后随着气温的下降, APX活性开始降低, 在 2011年 1 月 18 日(气温–20~ –8℃)陇油 7 号的APX活性接近 10月8日(气温14~20℃)水平, 而天油4号较10月8日下降44.78%。

两品种叶片APX活性呈“上升-下降-上升”的趋势, 10月 17日(气温8~17℃)陇油7号和天油4号APX活性是10月8日(气温14~20℃)的2.56倍和1.33倍, 而后由于气温的下降, APX 活性呈下降趋势, 在 10
月 31日(气温–2~12℃)时, 酶活性降到最低, 但 11月 15日(气温–20~–8℃)时, APX活性又开始上升, 这一变化趋势与低温胁迫下叶片中 APX基因表达量的变化一致。

同时陇油7号的APX活性明显高于天油4号, 说明在低温胁迫下, 陇油7号清除H2O2的能力强于天油4号。

3 讨论
生物或非生物胁迫会使植物产生过多的活性氧物质, 造成细胞膜和细胞器不同程度的损伤[15-16]。

细胞器中多种同工酶或非酶的抗氧化防御系统保证了细胞中的活性氧维持在正常水平, APX是这个系统中与H2O2亲和力最强的过氧化物酶, 其在响应逆境胁迫中具有重要的作用[17]。

本研究克隆了超强抗寒白菜型冬油菜APX 基因的cDNA序列, 氨基酸序列分析表明它拥有完整的编码框, 所编码蛋白与十字花科的大白菜和甘蓝具有极高的同源性, 保守区含有 APX蛋白保守序列, 属于植物的 POD超家族, 显示所克隆基因序列的准确性和该基因进化的保守性。

在逆境条件下, 植物的抗性与植物体内APX基因的表达以及酶活性水平具有密切关系。

本研究发现, 低温胁迫下 APX的表达量均高于对照, 且陇油7号的表达量比天油4号更加明显, 说明APX基因在冬油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。

前人已在番茄[8]、拟南芥[18]、橡胶树[19]等研究表明APX的过量表达可增强植物的抗寒性。

陇油 7号的酶活性高于天油4号, 这与低温胁迫下, APX活性越高植株的抗寒性越强[20-21]以及陇油7号比天油4号更抗寒一致, 也为进一步研究白菜型冬油菜品种陇油 7号的抗寒机制提供了方向。

低温胁迫下APX活性的提高远不如转录水平的提高明显, 说明APX可能存在转录水平上的调节、蛋白质翻译水平上的调节、酶原的激活, 也可能是mRNA以不转录的mRNP形式暂时储存起来[22]。

对植物来说, 不同部位、不同组织的APX活性存在差异[1]。

在自然降温条件下, 冬油菜根部 APX活性高于叶片, 说明 APX对清除根部 H2O2发挥重要作用。

根是北方寒区冬油菜越冬的唯一器官, 根部的 APX活性随气温的下降呈先上升后下降趋
势,这与根部APX基因表达量变化趋势一致, APX活性的升高是冬油菜经受低温胁迫过程中正常的防御性反应, 说明冬油菜根部抵御膜脂过氧化的能力提高,有利于根部经受更低温度或更长时间的低温胁迫,维持较高的抗寒力, 而后酶活性下降可能是由于经过前期的低温锻炼, 逐渐适应低温, 转入正常生长状态, 这符合冷驯化提高植物耐低温能力的分子机制[23-26]; 叶片中APX活性随温度降低呈现“上升−下降−上升”的趋势, 最初APX活性的升高可维持较高的抗寒力, 抵御最初的低温导致的膜脂过氧化, 而后逐渐适应了低温, 转入正常生长状态, APX活性下降, 但由于温度的大幅下降, 叶片内产生大量的H2O2, 又促使APX活性上升, 这与APX基因表达量的变化趋势一致。

4 结论
从超强抗寒白菜型冬油菜品种陇油7号获得了由753个核苷酸组成的APX基因ORF, 该基因编码250个氨基酸, 在进化上非常保守; APX基因编码亲水性蛋白, 由不规则卷曲和α螺旋组成, 属于植物的 POD超家族, 无信号肽。

与正常生长条件相比,在低温胁迫下 APX基因的表达量和酶活性均提高,超强抗寒性品种陇油7号APX基因表达量及酶活性高于抗寒性弱的耐寒品种天油 4号, 说明北方白菜型冬油菜APX基因表达和APX活性提高受低温胁迫诱导, 且有利于增强白菜型冬油菜抗寒性。

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