生物大分子印迹技术
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1982年，Reinhart 和Malamud将等电点聚焦 法分离蛋白质的凝胶作为印迹模板，他们又把 蛋白质印迹术称为Eastern blotting.
印迹过程及常用术语
凝胶电泳：与常规法电泳相同，但为了使 大分子容易迁出凝胶，常在不影响分辨率 的情况下尽可能采用大孔胶。印迹模板 （Blot templet)放在印迹缓冲液中浸泡，进 行印迹前平衡。
(c).于室温下静置温育5分钟，以促进核蛋白复合体 的解离。按每毫升TRIZOL\样品组织液加入0.2毫升 氯仿的比例加入氯仿，室温下剧烈摇动15秒，室温 温育3分钟。于4℃ 12000g离心15分钟。离心后， 混合物分为三相：下层红色的氯仿相，上层无色的 水相以及中间相。
(d).小心将上层无色的水相转移到另一个离心管中， 按1：1的比例加入异丙醇。于室温温育20分钟。于 4℃ 12000g离心10分钟。
6）从20ⅹ SSC中取出凝胶，将凝胶翻转以使其背面向上。把凝胶放于 平台上过湿润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。
7）用Parafilm膜围绕凝胶周边，但不是覆盖凝胶，以此作为屏障，阻止 液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。
8）在凝胶上方放置湿润的尼龙膜，并使两者的切角相重叠。尼龙膜和 凝胶之间不能有气泡。
印迹技术的发展及类型
生物大分子印迹技术创始于1975年，由苏格兰爱丁 堡大学E.M. Southern首先提出。他将限制性内切酶 消化后的DNA片段先进行琼脂糖凝胶电泳，已分离 的DNA各片段就在凝胶上用氢氧化钠处理使之变性 为单链。把一张硝酸纤维素纸（Nitrocellulose paper, 简称NC）放在凝胶上，利用毛细作用原理 使凝胶中的DNA片段转移到NC上使之固定化。此 时，固定化了的DNA片段经得起任何处理，可针对 所需DNA片段采用经放射性标记的RNA，在NC上 进行DNA-RNA分子杂交。最后经放射性自显影， 即可在底片上显现出一条杂交分子的区带。
印盖于检出 标记物，如抗体、地高辛、同位 素等。经过修饰而打上标记的配体，印迹术 中称为探针（Probe)。
印迹术的评价
1. 湿的固定化纸或膜柔软，容易操作和控制. 2. 被固定于固定化纸或膜表面的生物大分子，
可以均一地和各种配体起反应。 3. 印迹法使生物大分子浓集于固定化纸或膜
表面，提高了依据生物活性或抗原-抗体反应 性的检出灵敏度。 4. 去除变性剂容易，能使生物大分子较完全 地恢复到天然态。
RNA为单链分子，链内碱基容易配对形成二级结构。 不同的RNA分子空间结构不同，在未变性条件下， 其相对分子质量与电泳移动距离没有严格的相关性。 因此必须破坏RNA的空间结构后，在变性的条件下 电泳，才能使RNA移动距离与其相对分子质量对数 成正比。所有的操作过程必须在无RNase的环境中 进行，并需要用RNAase抑制剂0.1％焦碳酸二乙酯 （DEPC）的水溶液处理实验用品，操作中都应该 戴手套，防止人为造成的外源RNase的污染而引起 的RNA降解。
5. 对免疫印迹术而言，由于抗原已固定化于 印迹纸或膜上，故可检出那些不会产生沉淀 反应的抗原-抗体反应。
6. 现在已能做到一次印迹可得到多张复制品， 用于多种鉴定和分析。
7. 用共价键合法固定的生物分子，其探针可 像录音磁带那样被抹除，然后再用第二、第 三探针进行先后的探查，从而可以回答某一 区带是否具有多功能。
溶液 I: 50 mM 葡萄糖; 25 mM Tris-Cl (pH 8.0); 10 mM EDTA (pH 8.0); 溶液 II: 0.2 N NaOH (临用前用10mol/L贮存液现用现稀释); 1% (w/v)
SDS; 溶液 III: 5 M 乙酸钾, 60.0 ml; 冰乙酸 11.5 ml; 水, 28.5 ml 。
质粒的线性化
选择一个单一酶切位点（只切重组质粒一次 的酶），酶解使质粒线性化。此时的DNA若 是经过纯化的，无需RNase，否则需加 RNase。选择限制性内切酶时要注意：要在 插入片段的两侧寻找具有单一酶切位点的限 制酶，且产生3，overhangs的酶不要选用。 实验中选择EcoR Ⅰ、EcoR Ⅴ作为内切酶， 标记出来的探针为反义探针。
转膜
1）将凝胶用经DEPC处理的水淋洗数次以除去甲醛。如果 琼脂糖凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5Kb，需 用0.05M NaOH浸泡凝胶20分钟，以部分水解RNA并提高转 移效率。
2）无RNA酶的水淋洗凝胶，并用20ⅹSSC浸泡凝胶45分钟。 3）当凝胶仍浸于20ⅹSSC时，用一张Whatman 3MM滤纸
印迹（Blot）或称转移（Transfer）：是把 凝胶电泳已分离的区带转移于固定化纸或 膜上使之固定化的过程。这种固定化作用 可以是非共价结合（如NC纸），也可以是 共价结合。印迹的动力既可用电，也可利 用毛细作用，接触扩散等。
猝灭（Quenching)又称封闭（Blocking)。因 为印迹术的重要目的在于检出某种已分离的 功能性区带，而不是全谱的检出，因此，必 须把印迹纸或膜上的剩余活性基团先封闭再 进行检出。印迹术中这种和印迹纸或膜剩余 基团的结合称为非特异性背景结合 （Nonspecific background binding),并把它 比拟为噪声，而把亲和物双方在印迹纸或膜 上的结合称为特异性结合（Specific binding), 又比拟为信号。
合成DIG-Labeling RNA探针
文昌鱼成体不同组织总RNA的制备
一步法提取文昌鱼成体不同组织的总RNA 用TRIZOL试剂（购自GIBCO-BRL公司）提取文昌
鱼成体不同组织总RNA。提取总RNA过程中的所有 器皿均用DEPC处理并经过高压灭菌处理。 (a).按50-100 mg文昌鱼组织/每毫升TRIZOL试剂的 比例（1：10比例），将经研钵低温研磨的各个组 织加入TRIZOL试剂。充分摇匀组织。 (b).于4℃ 12000g离心10分钟，取上清，弃去不溶 解的组织碎片。
(e).弃上清，加入原组织液体积的 75％乙醇，用涡 旋振荡器振荡混匀。于4℃ 7500g离心5分钟，弃上 清。
(f).干燥器内干燥RNA沉淀，用不含RNA酶的灭菌水 （DEPC处理的） 溶解RNA，加入1l RNase Inhibitor。用分光光度计测定所得RNA的浓度，冻 存于－70℃。
甲醛电泳
印迹术可用于基因活化的研究。
印迹术被用于各种遗传疾病中功能畸变基因 的分析。
4. 印迹术在生物化学领域的应用
印迹术被广泛应用于各种生物分子间的相互 作用。
Bowen等人，用印迹术研究DNA-蛋白质和 RNA-蛋白质的相互作用。还研究了组蛋白 H2，H3和H4 之间的相互作用。粒的纯化
对线性化的质粒进行电泳，电泳完毕后，割下含DNA的琼脂 糖，使它尽可能小，放入1.5ml离心管中。注意要尽可能地 去掉不含DNA的琼脂糖，这样对提高质量和简化操作有好处； 按每100 mg琼脂糖加入300～600 l S1液的比例加入S1液， 置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化。每2分钟颠倒混 匀一次。如果琼脂糖重量小于100 mg，用ddH2O 补充至 100 mg，以确保总体积不至太小；加入1/3 S1液体积的异丙 醇，混匀，55℃温浴1分钟；将溶化的Agarose液移入吸附 柱，离心1分钟，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同 一收集管中；在吸附柱中加入450 l W1 液，静置1分钟后， 离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管 中；在吸附柱中加入450 l W1 液，离心15秒，倒掉收集管 中的液体，将吸附柱放入同一收集管中；离心1分钟；将吸 附柱放入一个干净的1.5 ml 的RNase-free的离心管中，在吸 附膜中央加入20 l DEPC处理的ddH2O液，4℃ 5小时或过 夜，离心1分钟；取1l电泳检测。将1.5 ml的离心管（DNA） 储存于－20℃。
1976年，法国Chambon小组，发现真核生物 基因具有不编码的插入序列。
1977年，Alwine等人将印迹技术应用于RNA 研究上，创建了Northern blotting.
1979年，Towbin等首先把印迹术应用于抗原 检出，并称为免疫印迹术（Immunoblotting）
1981年，Burnette把免疫印迹术称为Western blotting.
和灵敏的筛选抗原和抗血清的技术。免疫印 迹术常被用来作为抗原特性的描述；用于血 清学上鉴别的目的；鉴定抗体特异性；制备 表位谱（Epitope mapping)，分析非抗体配 体类对其受体的特异性结合。鉴定肿瘤相关 抗原。免疫印迹术也被用来检出免疫学上起 交叉反应的蛋白质的电泳变异型。
2. 在医学领域的应用 印迹术可为诊断、治疗
8. 生物分子被固定化后增加了稳定性，印迹 区带不会扩散，容易贮藏。
9. 对同位素检出法而言，由于 固定化纸或膜很薄，可以提高 放射自显影的效率；尤其是低 能量射线，也能通过印迹术而 获得满意的效果。
10. 印迹术所用设备简单，可 以自制。
印迹术的应用
1. 在免疫学中的应用 印迹术是一种快速
和了解疾病的病理，尤其是免疫病理，提供有力的 工具。现在已经用印迹抗原来测定各种病人的抗体 谱。有的已经直接用免疫印迹术作为临床检验的手 段。
3. 在分子生物学领域的应用
测定某种基因是否属断裂基因，这种断裂基 因汉多少内含子等。
分析DNA甲基化对基因表达的作用。在高等 真核生物的DNA中，部分胞苷残基已被甲基 化，基因中的甲基化程度可用印迹术来分析
Northern Blotting
质粒的提取 质粒的线性化 线性化质粒的纯化 合成DIG-Labeled RNA探针 文昌鱼不同组织总RNA的制备 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 转膜 杂交及检测
质粒的提取
参分子克隆第三版方法。挑取单菌落，37℃ LB培养基（Amp＋）中培 养16h, 剧烈振荡；取30毫升菌液于50毫升大离心管，4800rpm离心 10min，4℃; 倾出培养液，使细菌沉淀尽可能干燥；用0.6毫升Solution 1打匀，冰浴5min，转入5毫升离心管；加入1.2毫升现配的Solution 2， 颠倒5次，冰浴5min，时间不能延长；加入0.9毫升Solution 3，颠倒数 次，混匀，置冰上5min；4℃离心，12000rpm，10min；加入等体积的 酚：氯仿（1：1），抽提，离心12000rpm，5min，4℃；取上清，重复 抽提一次。取上清，加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温放置20min 或更长；离心，12000rpm，15min，4℃；去上清，沉淀用1毫升预冷的 70％的乙醇洗涤，放置10min；离心，12000rpm，5min，4℃；去上清， 干燥；加300l无菌水溶解，加入DNase－free RNase A，使终浓度为 20g/ml 37℃水浴，30min；－20℃保存。取适量用分光光度计进行定 量。其中，溶液1，2，3的配制如下：
包裹一块有机玻璃，做成一个长和宽均大于凝胶的平台。将 包裹住的平台放入一个大的干烤皿内，加入转移缓冲液 （20ⅹ SSC），使液面略低于平台表面。当平台上方的 3MM滤纸浸透后，用玻璃棒赶走所有的气泡。 4）裁一张尼龙膜，长和宽应分别比凝胶大1mm，接触尼龙 膜时需要戴着手套或用平头镊子。
5）将尼龙膜浮在去离子水表面，直至从下向上湿透为止，随后 20ⅹSSC浸泡尼龙膜至少5分钟，切去尼龙膜的一角，使其与凝胶的切 角相对应。
9）用2ⅹ SSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3MM滤纸，置于湿润的 尼龙膜上方，用玻璃棒赶走尼龙膜与滤纸之间的气泡。
10) 切一叠略小于3MM滤纸的纸巾，将其放置在3MM滤纸的上方，并在 纸巾上方放一块玻璃板，然后用一500g的重物压实。
11）使上述RNA转移持续进行16－24小时，每当纸巾浸湿后，应更换新 的纸巾。转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸，翻转凝胶和尼 龙膜，用铅笔在尼龙膜上标记凝胶加样孔的位置。
印迹过程及常用术语
凝胶电泳：与常规法电泳相同，但为了使 大分子容易迁出凝胶，常在不影响分辨率 的情况下尽可能采用大孔胶。印迹模板 （Blot templet)放在印迹缓冲液中浸泡，进 行印迹前平衡。
(c).于室温下静置温育5分钟，以促进核蛋白复合体 的解离。按每毫升TRIZOL\样品组织液加入0.2毫升 氯仿的比例加入氯仿，室温下剧烈摇动15秒，室温 温育3分钟。于4℃ 12000g离心15分钟。离心后， 混合物分为三相：下层红色的氯仿相，上层无色的 水相以及中间相。
(d).小心将上层无色的水相转移到另一个离心管中， 按1：1的比例加入异丙醇。于室温温育20分钟。于 4℃ 12000g离心10分钟。
6）从20ⅹ SSC中取出凝胶，将凝胶翻转以使其背面向上。把凝胶放于 平台上过湿润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。
7）用Parafilm膜围绕凝胶周边，但不是覆盖凝胶，以此作为屏障，阻止 液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。
8）在凝胶上方放置湿润的尼龙膜，并使两者的切角相重叠。尼龙膜和 凝胶之间不能有气泡。
印迹技术的发展及类型
生物大分子印迹技术创始于1975年，由苏格兰爱丁 堡大学E.M. Southern首先提出。他将限制性内切酶 消化后的DNA片段先进行琼脂糖凝胶电泳，已分离 的DNA各片段就在凝胶上用氢氧化钠处理使之变性 为单链。把一张硝酸纤维素纸（Nitrocellulose paper, 简称NC）放在凝胶上，利用毛细作用原理 使凝胶中的DNA片段转移到NC上使之固定化。此 时，固定化了的DNA片段经得起任何处理，可针对 所需DNA片段采用经放射性标记的RNA，在NC上 进行DNA-RNA分子杂交。最后经放射性自显影， 即可在底片上显现出一条杂交分子的区带。
印盖于检出 标记物，如抗体、地高辛、同位 素等。经过修饰而打上标记的配体，印迹术 中称为探针（Probe)。
印迹术的评价
1. 湿的固定化纸或膜柔软，容易操作和控制. 2. 被固定于固定化纸或膜表面的生物大分子，
可以均一地和各种配体起反应。 3. 印迹法使生物大分子浓集于固定化纸或膜
表面，提高了依据生物活性或抗原-抗体反应 性的检出灵敏度。 4. 去除变性剂容易，能使生物大分子较完全 地恢复到天然态。
RNA为单链分子，链内碱基容易配对形成二级结构。 不同的RNA分子空间结构不同，在未变性条件下， 其相对分子质量与电泳移动距离没有严格的相关性。 因此必须破坏RNA的空间结构后，在变性的条件下 电泳，才能使RNA移动距离与其相对分子质量对数 成正比。所有的操作过程必须在无RNase的环境中 进行，并需要用RNAase抑制剂0.1％焦碳酸二乙酯 （DEPC）的水溶液处理实验用品，操作中都应该 戴手套，防止人为造成的外源RNase的污染而引起 的RNA降解。
5. 对免疫印迹术而言，由于抗原已固定化于 印迹纸或膜上，故可检出那些不会产生沉淀 反应的抗原-抗体反应。
6. 现在已能做到一次印迹可得到多张复制品， 用于多种鉴定和分析。
7. 用共价键合法固定的生物分子，其探针可 像录音磁带那样被抹除，然后再用第二、第 三探针进行先后的探查，从而可以回答某一 区带是否具有多功能。
溶液 I: 50 mM 葡萄糖; 25 mM Tris-Cl (pH 8.0); 10 mM EDTA (pH 8.0); 溶液 II: 0.2 N NaOH (临用前用10mol/L贮存液现用现稀释); 1% (w/v)
SDS; 溶液 III: 5 M 乙酸钾, 60.0 ml; 冰乙酸 11.5 ml; 水, 28.5 ml 。
质粒的线性化
选择一个单一酶切位点（只切重组质粒一次 的酶），酶解使质粒线性化。此时的DNA若 是经过纯化的，无需RNase，否则需加 RNase。选择限制性内切酶时要注意：要在 插入片段的两侧寻找具有单一酶切位点的限 制酶，且产生3，overhangs的酶不要选用。 实验中选择EcoR Ⅰ、EcoR Ⅴ作为内切酶， 标记出来的探针为反义探针。
转膜
1）将凝胶用经DEPC处理的水淋洗数次以除去甲醛。如果 琼脂糖凝胶厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5Kb，需 用0.05M NaOH浸泡凝胶20分钟，以部分水解RNA并提高转 移效率。
2）无RNA酶的水淋洗凝胶，并用20ⅹSSC浸泡凝胶45分钟。 3）当凝胶仍浸于20ⅹSSC时，用一张Whatman 3MM滤纸
印迹（Blot）或称转移（Transfer）：是把 凝胶电泳已分离的区带转移于固定化纸或 膜上使之固定化的过程。这种固定化作用 可以是非共价结合（如NC纸），也可以是 共价结合。印迹的动力既可用电，也可利 用毛细作用，接触扩散等。
猝灭（Quenching)又称封闭（Blocking)。因 为印迹术的重要目的在于检出某种已分离的 功能性区带，而不是全谱的检出，因此，必 须把印迹纸或膜上的剩余活性基团先封闭再 进行检出。印迹术中这种和印迹纸或膜剩余 基团的结合称为非特异性背景结合 （Nonspecific background binding),并把它 比拟为噪声，而把亲和物双方在印迹纸或膜 上的结合称为特异性结合（Specific binding), 又比拟为信号。
合成DIG-Labeling RNA探针
文昌鱼成体不同组织总RNA的制备
一步法提取文昌鱼成体不同组织的总RNA 用TRIZOL试剂（购自GIBCO-BRL公司）提取文昌
鱼成体不同组织总RNA。提取总RNA过程中的所有 器皿均用DEPC处理并经过高压灭菌处理。 (a).按50-100 mg文昌鱼组织/每毫升TRIZOL试剂的 比例（1：10比例），将经研钵低温研磨的各个组 织加入TRIZOL试剂。充分摇匀组织。 (b).于4℃ 12000g离心10分钟，取上清，弃去不溶 解的组织碎片。
(e).弃上清，加入原组织液体积的 75％乙醇，用涡 旋振荡器振荡混匀。于4℃ 7500g离心5分钟，弃上 清。
(f).干燥器内干燥RNA沉淀，用不含RNA酶的灭菌水 （DEPC处理的） 溶解RNA，加入1l RNase Inhibitor。用分光光度计测定所得RNA的浓度，冻 存于－70℃。
甲醛电泳
印迹术可用于基因活化的研究。
印迹术被用于各种遗传疾病中功能畸变基因 的分析。
4. 印迹术在生物化学领域的应用
印迹术被广泛应用于各种生物分子间的相互 作用。
Bowen等人，用印迹术研究DNA-蛋白质和 RNA-蛋白质的相互作用。还研究了组蛋白 H2，H3和H4 之间的相互作用。粒的纯化
对线性化的质粒进行电泳，电泳完毕后，割下含DNA的琼脂 糖，使它尽可能小，放入1.5ml离心管中。注意要尽可能地 去掉不含DNA的琼脂糖，这样对提高质量和简化操作有好处； 按每100 mg琼脂糖加入300～600 l S1液的比例加入S1液， 置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化。每2分钟颠倒混 匀一次。如果琼脂糖重量小于100 mg，用ddH2O 补充至 100 mg，以确保总体积不至太小；加入1/3 S1液体积的异丙 醇，混匀，55℃温浴1分钟；将溶化的Agarose液移入吸附 柱，离心1分钟，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同 一收集管中；在吸附柱中加入450 l W1 液，静置1分钟后， 离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管 中；在吸附柱中加入450 l W1 液，离心15秒，倒掉收集管 中的液体，将吸附柱放入同一收集管中；离心1分钟；将吸 附柱放入一个干净的1.5 ml 的RNase-free的离心管中，在吸 附膜中央加入20 l DEPC处理的ddH2O液，4℃ 5小时或过 夜，离心1分钟；取1l电泳检测。将1.5 ml的离心管（DNA） 储存于－20℃。
1976年，法国Chambon小组，发现真核生物 基因具有不编码的插入序列。
1977年，Alwine等人将印迹技术应用于RNA 研究上，创建了Northern blotting.
1979年，Towbin等首先把印迹术应用于抗原 检出，并称为免疫印迹术（Immunoblotting）
1981年，Burnette把免疫印迹术称为Western blotting.
和灵敏的筛选抗原和抗血清的技术。免疫印 迹术常被用来作为抗原特性的描述；用于血 清学上鉴别的目的；鉴定抗体特异性；制备 表位谱（Epitope mapping)，分析非抗体配 体类对其受体的特异性结合。鉴定肿瘤相关 抗原。免疫印迹术也被用来检出免疫学上起 交叉反应的蛋白质的电泳变异型。
2. 在医学领域的应用 印迹术可为诊断、治疗
8. 生物分子被固定化后增加了稳定性，印迹 区带不会扩散，容易贮藏。
9. 对同位素检出法而言，由于 固定化纸或膜很薄，可以提高 放射自显影的效率；尤其是低 能量射线，也能通过印迹术而 获得满意的效果。
10. 印迹术所用设备简单，可 以自制。
印迹术的应用
1. 在免疫学中的应用 印迹术是一种快速
和了解疾病的病理，尤其是免疫病理，提供有力的 工具。现在已经用印迹抗原来测定各种病人的抗体 谱。有的已经直接用免疫印迹术作为临床检验的手 段。
3. 在分子生物学领域的应用
测定某种基因是否属断裂基因，这种断裂基 因汉多少内含子等。
分析DNA甲基化对基因表达的作用。在高等 真核生物的DNA中，部分胞苷残基已被甲基 化，基因中的甲基化程度可用印迹术来分析
Northern Blotting
质粒的提取 质粒的线性化 线性化质粒的纯化 合成DIG-Labeled RNA探针 文昌鱼不同组织总RNA的制备 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 转膜 杂交及检测
质粒的提取
参分子克隆第三版方法。挑取单菌落，37℃ LB培养基（Amp＋）中培 养16h, 剧烈振荡；取30毫升菌液于50毫升大离心管，4800rpm离心 10min，4℃; 倾出培养液，使细菌沉淀尽可能干燥；用0.6毫升Solution 1打匀，冰浴5min，转入5毫升离心管；加入1.2毫升现配的Solution 2， 颠倒5次，冰浴5min，时间不能延长；加入0.9毫升Solution 3，颠倒数 次，混匀，置冰上5min；4℃离心，12000rpm，10min；加入等体积的 酚：氯仿（1：1），抽提，离心12000rpm，5min，4℃；取上清，重复 抽提一次。取上清，加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温放置20min 或更长；离心，12000rpm，15min，4℃；去上清，沉淀用1毫升预冷的 70％的乙醇洗涤，放置10min；离心，12000rpm，5min，4℃；去上清， 干燥；加300l无菌水溶解，加入DNase－free RNase A，使终浓度为 20g/ml 37℃水浴，30min；－20℃保存。取适量用分光光度计进行定 量。其中，溶液1，2，3的配制如下：
包裹一块有机玻璃，做成一个长和宽均大于凝胶的平台。将 包裹住的平台放入一个大的干烤皿内，加入转移缓冲液 （20ⅹ SSC），使液面略低于平台表面。当平台上方的 3MM滤纸浸透后，用玻璃棒赶走所有的气泡。 4）裁一张尼龙膜，长和宽应分别比凝胶大1mm，接触尼龙 膜时需要戴着手套或用平头镊子。
5）将尼龙膜浮在去离子水表面，直至从下向上湿透为止，随后 20ⅹSSC浸泡尼龙膜至少5分钟，切去尼龙膜的一角，使其与凝胶的切 角相对应。
9）用2ⅹ SSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3MM滤纸，置于湿润的 尼龙膜上方，用玻璃棒赶走尼龙膜与滤纸之间的气泡。
10) 切一叠略小于3MM滤纸的纸巾，将其放置在3MM滤纸的上方，并在 纸巾上方放一块玻璃板，然后用一500g的重物压实。
11）使上述RNA转移持续进行16－24小时，每当纸巾浸湿后，应更换新 的纸巾。转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸，翻转凝胶和尼 龙膜，用铅笔在尼龙膜上标记凝胶加样孔的位置。