药学本科药物分析自主设计性实验的实践探索

药学本科药物分析自主设计性实验的实践探索
韩晓璐;刘悦;闻俊;洪战英;范国荣;柴逸峰
【摘要】为了让学生更好的学习与实践药品质量标准制定中含量测定方法建立与
评价过程，教学中开展药品含量测定方法学研究的自主设计性实验。

实验教学以小组为单位进行，学生自主查阅文献、讨论设计实验方案，并在老师指导下修改方案。

小组合作完成苯磺酸氨氯地平片含量测定方法建立与评价后，对实验结果进行合理分析得出结论，并对设计性实验教学过程进行总结和讨论。

%To help students
to understand and practice the development and validation of the assay in drug quality standard better , an autonomous -designed experiment of pharmaceutical determination was implemented in teaching
course.Students were divided into several groups to retrieve literatures , discuss and improve the designed protocol with the teacher's guide.After accomplishing the whole experiment including development and validation of determination of amlodipine besylate tablet , the data was analyzed and come to a conclusion of the assay.In the end , the procedures of the designed experiment were summarized and discussed.【期刊名称】《广州化工》
【年(卷),期】2014(000)015
【总页数】3页(P230-232)
【关键词】药物分析;自主设计性实验;苯磺酸氨氯地平片;含量测定
【作者】韩晓璐;刘悦;闻俊;洪战英;范国荣;柴逸峰
【作者单位】第二军医大学药学院，上海 200433;第二军医大学药学院，上海200433;第二军医大学药学院，上海 200433; 上海市药物中药代谢产物研究重点实验室，上海 200433;第二军医大学药学院，上海 200433; 上海市药物中药代谢产物研究重点实验室，上海 200433;第二军医大学药学院，上海 200433; 上海市药物中药代谢产物研究重点实验室，上海 200433;第二军医大学药学院，上海200433; 上海市药物中药代谢产物研究重点实验室，上海 200433
【正文语种】中文
【中图分类】R917
药物分析学是一门理论联系实际的实践性学科，是药学本科教育中必不可少的专业课之一。

为了让药学专业学生在学习理论知识的同时熟悉药物分析方法在药品质量控制过程中的实际应用，《药物分析》授课期间开展了自主设计实验。

以苯磺酸氨氯地平片含量测定方法建立及评价为实验任务，以药物含量测定方法学验证为教学目标，在实践过程中培养学生分析问题、文献查阅、实验设计、团队合作等方面的能力，提升学员科研素质和专业素养，加深药物分析专业课程的理解和认知［1－2］。

1 实验准备
合理可行的实验方案是保证自主设计性实验顺利进行的先决条件。

在老师布置了本次实验任务后，我们根据药物的结构特点、理化性质选择合适的含量测定方法，继而着手进行文献查阅与方法学验证过程的学习，通过讨论交流确定最终实验方案，并予以实施;最后根据实验数据进行结果分析和讨论，按药典格式撰写药品质量标准中的“含量测定”项，同时按照科研论文形式递交与实验相关的论文。

1.1 文献查阅与整理
本组成员共7 人，根据实验任务，指定2 人查阅文献，鉴于药典上没有氨氯地平
片含量测定的方法，以氨氯地平、含量测定为关键词进行中文文献检索，检索范围包括sinomed、重庆维普等数字资源以及通过百度、谷歌等搜索引擎进行互联网
检索。

本次检索共得到相关中文文献12 篇，其中6 篇关于片剂［3－8］的含量
测定，其余为口腔崩解片、粘附片［9－10］和胶囊［11］的含量测定等，上述文献均采用高效液相色谱法对苯磺酸氨氯地平进行含量测定。

根据文献资料，高效液相色谱外标法定量更适合本实验室条件，氨氯地平在50 μg/mL 时色谱峰峰形对称，理论塔板数符合要求。

根据该浓度确定工作曲线范围为30 ～70 μg/mL;初定流动相为甲醇－0.03 mol/L NaH2PO4(65∶35)。

1.2 确定方案和流程安排
药物含量测定的方法学验证需进行专属性、灵敏度、线性、范围、精密度、准确度、耐用性的考察。

根据文献和教科书上相关内容，初步拟定了高效液相色谱法建立及方法学评价的实验步骤，并且在与老师讨论中将部分实验细节明确，使实验方案真正成为可供操作的流程指导。

实验中的药品与试剂全部根据实验方案进行估算，试液、缓冲液等则依据《中国药典》附录及相关文献要求配制，实验前将所需仪器和试药清单交予老师。

实验过程中安排4 人负责试剂、试液配制，3 人负责高效液
相色谱分析部分，包括进样和数据处理。

第一次实验包括方法建立及色谱系统适用性试验、专属性试验、线性和范围考察;第二次实验中主要以精密度、准确度考察
为主，并且对供试品进行含量测定。

另外用课后时间进行酸、碱破坏的专属性考察。

2 仪器与试药
高效液相色谱仪，日本岛津公司;包括LC－10AD 色谱泵，SPD－10A 紫外检测器，Rheodyne7725i 手动进样阀;数据采集由N2000 工作站执行，浙江大学;HA－
202M 电子天平(十万分之一)，日本A＆D 公司。

苯磺酸氨氯地平对照品(含量＞99.4%上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室提
供);苯磺酸氨氯地平片(以氨氯地平计为5 mg/片，批号H20066843)，宜昌长江
药业有限公司;甲醇(色谱纯)，美国天地公司;磷酸二氢钠(分析纯)，国药集团化学试剂公司;去离子水由实验室自制。

3 方法与结果
3.1 溶液制备
3.1.1 对照品溶液制备
精密称取苯磺酸氨氯地平粉末约0.13 g，相当于氨氯地平约0.1 g，置于100 mL 量瓶中，用甲醇溶解，稀释至刻度，得对照品储备液。

3.1.2 供试品溶液配制
取15 片苯磺酸氨氯地平片，精密称定，研细，精密称取片粉适量(约相当于氨氯
地平2.5 mg)置50 mL 量瓶中，用流动相稀释并超声15 min，静置至室温后，用流动相稀释至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

3.2 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱为C18 烷基硅烷键合硅胶柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)(日本岛津公司);流动相为甲醇－0.03 mol/L NaH2PO4(65∶35)，流速为1.0 mL/min，柱温为室温，紫外检测波长237 nm，进样量20 μL。

典型色谱图见图1，氨氯地平保留时间为5.2 min，理论塔板数大于4 000。

图1 系统适用性实验色谱图1－氨氯地平Fig.1 HPLC chromatogram of system suitability test.1－Amlodipine
3.3 专属性
3.3.1 酸破坏
取1 mL 苯磺酸氨氯地平对照品储备液置于10 mL 量瓶中，加入1 mol/L HCl 溶液2 mL，室温下放置1 h 后，加入浓度为1 mol/L 的NaOH 溶液2 mL 中和，
用流动相稀释至刻度。

进样20 μL，色谱图显示氨氯地平色谱峰与破坏前无明显差
异。

3.3.2 碱破坏
取1 mL 苯磺酸氨氯地平对照品储备液置于10 mL 量瓶中，加入0.1 mol/L NaOH 溶液1 mL，置于水浴中加热30 min，取出放冷至室温，加入0.1 mol/L HCl 溶液1 mL，用流动相稀释至刻度。

进样20 μL，色谱图见图2，氨氯地平色
谱峰峰高明显改变，产生新的降解产物，且不干扰氨氯地平主峰测定，显示出本色谱条件的专属性良好。

图2 碱破坏试验色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of desgrade experiment
by base
3.4 标准曲线绘制
精密量取对照品储备液0.15、0.20、0.25、0、30、0.35 mL，分别置于5 mL 量瓶中，加流动相稀释至刻度，得浓度为30、40、50、60、70 μg/mL 的对照品溶液。

依次吸取上述溶液各20 μL 进样分析，以对照品溶液浓度(c，μg/mL)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，得线性回归方程A=25543c+69180，r=0.9990，表明
氨氯地平在浓度为30 ～70 μg/mL 内，线性良好。

3.5 重复性试验
按3.1.2 项下分别配制6 份供试品溶液进样分析，测定峰面积，计算含量，苯磺酸氨氯地平片平均标示量的百分含量为98.2%，RSD 为3.5%。

3.6 加样回收率试验
分别精密称取片粉约0.030 7 g(相当于氨氯地平1.25 mg)置于9 个50 mL 量瓶中，平均分成3 组，在上述3 组量瓶中分别精密量取对照品储备液0.75，1.25，1.75 mL，加适量流动相，超声溶解后定容，过滤，得测定浓度80%、100%和120%的供试品溶液各3 组。

分别测定其峰面积，以峰面积外标法计算加样回收率，测得平均加样回收率为98.8%，RSD 为2.3%。

3.7 样品测定
按照3.1.1 项配制50 μg/mL 氨氯地平对照品溶液，取苯磺酸氨氯地平片15 片，按照3.1.2 项配制供试品溶液，精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算。

结果测得批号为H20066843 的供试品中，氨氯地平含量为标示量的97.2%。

4 实验总结与体会
整个实验从前期文献调研、设计实验方案到最后数据处理、总结汇报共持续5 周
的时间。

对于第一次进行定量分析研究自主设计性实验来说，实验过程中遇到的很多问题都给让我们思考了很多。

学习如何分析问题，并用所学知识去解决问题的思维活动是自主设计性实验给予的最大收获。

4.1 文献调研需要全面
自主设计性实验对学生文献查阅、综合整理能力要求较高，在前期文献查阅过程中，只进行了中文文献的查阅，虽然在对文献进行分析后制定出了相对完善的实验方案，但依旧存在很多不足，如:流动相比例的选择与pH 的考察，在本次实验中并没有
进行相对完善的实验研究，仅仅是在一两次实验基础上确定下了色谱条件，并不符合科学研究中循序渐进的严谨的实验态度。

如果前期多查阅一些英文文献，以对中文文献做更好的补充，实验设计中将会发现更优的实验条件与设计思路。

4.2 方案设计应该理论结合实际
大多数的实验课上，我们都是按照实验教材或者老师教授的步骤进行实验，所有的试剂、药品、仪器等都由老师提供和准备，而在设计性实验中，上述实验准备需要自己完成，于是就出现了很多考虑不足的地方。

例如在溶液配制过程中，未能综合的考虑所用仪器的精度、玻璃仪器的规格、实际需要用量等，配制的溶液需要的对照品或者供试品无法精密称定或者溶液无法精密量取，致使在实验中，不得不将最初实验方案中的配制体积与浓度都进行改进，浪费了实验时间。

4.3 实验预习和预实验的重要性
由于教学进度原因，实验操作时间只有2 次课共10 个学时。

虽然在前期课程中已经学习了高效液相色谱仪的操作，但是实际实验中仍然感到陌生，对仪器操作流程也不是很清楚，屡屡犯错。

而由于实验安排不合理或仪器操作不当引起的问题，也导致部分实验不得不在周末课后继续进行。

这些都让我们认识到了实验前充分预习和合理安排实验进程的重要性。

于是在第二次实验时，负责溶液配制的同学在充分预习每一步实验操作后提前一个小时开始配制所需溶液，使得溶液配制和仪器分析过程衔接紧密，提高了实验效率。

另外由于验证性实验都是一次完成，而自主设计性实验中会遇到太多的不确定因素，根据预实验结果优化色谱条件及安排实验流程也是应该在实验中考虑的内容。

两次实验实施教学中体会到流程明显不同的原因，正是由于前期预实验的教训和后期实验预习的充分，逐渐理清了实验思路，才能有条不紊的把含量测定方法学验证进行下去。

4.4 实现绿色实验操作
在保证实验用量及数据准确的前提下合理优化实验操作，仔细计算化学试剂用量，做好严格的统筹安排，实现实验过程的绿色环保操作。

实验所用的方法为HPLC 法，每次进样量仅为20 μL，所以在配制实验所需溶液应充分考虑所用体积，不造成浪费，比如在回收率实验中，将原本的100 mL 量瓶改为50 mL 量瓶，减少对照品和有机溶剂用量。

色谱流动相中含有0.3 mol/L 的NaH2PO4，长期放置可能会有微生物滋生，影响流动相性质，损坏色谱柱或造成结果错误，所以应该现配现用，并满足当次实验用量。

4.5 强化团队的分工协作
以小组为单位完成的综合实验要求实验小组中每个成员都清楚整个的实验的目的、任务以及实验过程的原理和流程，做到分工明确、步调统一，每个人首先能对自己负责的部分认真完成，并做好详细的实验记录;同时又对其他同学的实验环节做到
心中有数。

一旦某个实验环节出现问题，负责人能够清楚的了解如何补救;而一旦
某个实验结果或者数据出现问题，可以根据各成员的原始记录寻找原因，综合分析，着手解决。

在既有分工又保持合作的基础上，才不会因为一个环节的出错而导致整个实验失败，才能够高效、高质量的完成整个药品含量测定方法建立与验证。

对药学专业本科生来说，在课堂教学中进行药物分析自主设计性实验，能够帮助学生熟悉药物含量测定方法学研究流程，不仅提升了实验技能，巩固了专业知识，培养了团队协作能力，更重要的是锻炼了自己分析问题和解决问题的能力。

我们充分认识到，扎实的专业基础知识和清晰连贯的科研思维对于实验研究相当重要。

药物分析本身就是一门实践与理论并重的学科，我们的学习不能仅仅局限在教科书上，如何把这门学科应用药学研究中去应该是每个药学本科生应该思考和实践的。

药物分析自主设计性实验的训练，将会极大的促进我们在今后的学习中注重能力的培养，利用好课堂给我们提供的实验条件，动脑与动手并重，更好的适应未来工作的需求。

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