基于纯水提取的烟熏鲣鱼中肌苷酸的提取方法

基于纯水提取的烟熏鲣鱼中肌苷酸的提取方法
王婷婷;陈易晖;胡敏杰;李雪珍
【摘要】A novel method for the extraction of inosinic acid in Smoked Katsuwonus pelamis based on water was developed. The inosinic acid was extracted by 95 ℃ water for 5 min. The subsequent analysis of inosinic acid was achieved on an Agilent Zorbax SB-C18 column (150 mm x 4. 6 mm, 5 μm) with the mobile phase of methanol-50 mmol/L ammonium acetate (5: 95, v/v) at a flow rate of 1. 0 mL/min at 30 ℃. The detection wavelength was set at 254 nm. The results showed that the linear range for inosinic acid in Smoked Katsuwonus pelamis was between 1. 0 mg/L and 120. 0 mg/L with the limit of detection (LOD, S/N = 3) of 4 mg/kg and the limit of quantification (LOQ, S/N = 10) of 12 mg/kg. At the spiked levels of 0. 40, 2. 00, 4. 00 g/kg (n = 3), the recoveries ranged from 84. 6% to 100. 2% with the relative standard deviations (RSDs) between 1. 00% and 6. 12%. Compared with traditional extraction method by perchloric acid, the extraction efficiency was improved by 37. 0%. The novel method is safe, stable and accurate for the determination of inosinic acid in Smoked Katsuwonus pelamis, which can also be applied to the determination of inosinic acid in other foods and deserved to be spread.%建立了一种基于纯水提取的新型烟熏鲣鱼中肌苷酸的提取方法.样品前处理采用95℃的纯水作为提取液,提取5 min.采用的色谱条件:色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱(150 mm
×4.6 mm,5μm),柱温为30℃,流动相为甲醇-50 mmol/L乙酸铵水溶液(5:95,v/v),流速为1.0 mL/min,检测波长为254 nm.结果表明,该方法测定烟熏鲣鱼中肌苷酸
含量的线性范围为1.0～120.0 mg/L；在0.40、2.00、4.00 g/kg(n=3)的添加水平下,回收率为84.6％～100.2％,测定结果的相对标准偏差(RSD)为1.00％～
6.12％；检出限(信噪比(S/N)为3)为4 mg/kg；定量限(S/N=10)为12 mg/kg.该方法与常规采用的基于高氯酸的提取方法相比较,提取效率提高了3
7.0％,并且该方法操作安全、与环境友好,对烟熏鲣鱼中肌苷酸含量测定准确度良好,对其他食品中肌苷酸含量的测定具有借鉴意义,是一种值得推广的样品预处理方法.
【期刊名称】《色谱》
【年(卷),期】2012(030)002
【总页数】4页(P215-218)
【关键词】纯水提取;高效液相色谱;肌苷酸;烟熏鲣鱼
【作者】王婷婷;陈易晖;胡敏杰;李雪珍
【作者单位】宁波工程学院化工学院,浙江宁波315016;象山出入境检验检疫局,浙江象山310014;宁波工程学院化工学院,浙江宁波315016;象山出入境检验检疫局,浙江象山310014
【正文语种】中文
【中图分类】O658
鲣鱼(Katsuwonus pelamis)属鲈形目鲭科鲣鱼属，是全球金枪鱼渔业中最为重要的目标鱼种，主要产于印度洋、太平洋和大西洋，我国东海和南海也可以大量捕获［1，2］。

鲣鱼在日本被使用特殊工艺煮熟，剔除鱼刺后反复烟熏多次，制成烟熏鲣鱼(Smoked Katsuwonus pelamis)，因其硬如木块，故也称为“木鱼”，用
这种烟熏鲣鱼为主要成分并配合各种氨基酸和核酸原料制成的颗粒状调味品又被称为“木鱼精”，它是日本家庭和日本料理餐馆最常用的调味品之一，具有独特的鱼鲜味和香味。

烟熏鲣鱼中主要的鲜味成分是肌苷酸(inosinic acid)［3，4］。

肌苷酸又称为次黄嘌呤核苷酸，最早于1847年由德国的化学家Liebig在牛肉组织中发现，1913年Kodama和Kuninuka发现肌苷酸的鲜味特征［5］，其增加鲜味的能力比谷氨酸钠强几十倍，其含量是衡量肉质鲜味的一项重要指标［6］。

肌苷酸是一种芳香族化合物，易溶于水，在中性和碱性溶液中稳定，在pH＜4的条件下稳定性较差，容易降解为次黄嘌呤和D-核糖［7，8］。

但是，目前动物及其他产品中的肌苷酸含量研究普遍采用高氯酸作为提取液［9－15］，例如，Zhang等［9］采用5%高氯酸提取畜禽肌肉中的肌苷酸;吴莹莹等［10］采用6%高氯酸提取新鲜肉鸡胸肌中的肌苷酸;温泉等［11］采用5%高氯酸提取猪肉中的呈味核苷酸肌苷酸;吴波等［12］采用5%的高氯酸提取酱油中的肌苷酸等。

高氯酸作为提取液的pH值远小于1，易造成肌苷酸的降解，导致测定结果的误差。

此外，由于高氯酸具有强腐蚀性和强刺激性，极易在样品预处理时引发安全事故，造成环境的污染。

因此，本文建立了以95℃的纯水作为提取液，提取5 min的肌苷酸预处理方法，并采用高效液相色谱法(HPLC)对烟熏鲣鱼中的肌苷酸进行了定性和定量分析。

与传统的高氯酸提取方法相比，该方法操作安全、与环境友好，且提取效率高，是一个具有较强实用性的检测方法，具有一定的推广价值。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Agilent高效液相色谱仪LC1100(美国Agilent公司，配紫外检测器);均质器(瑞士Kinematica公司，PT 2100型);高速离心机(德国Sigma公司，3K15);数显恒温水浴锅(HH-16，国华电器有限公司);滤膜(美国Agilent公司，13 mm×0.45 μm)。

肌苷酸标准品(纯度为99%，德国Sigma公司);烟熏鲣鱼(象山三英水产有限公司);
甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司);乙酸铵(分析纯，国药集团);高氯酸(优级纯，含量70%～72%，天津光复精细化工研究所);其他试剂均为国产分析纯。

1.2 标准溶液的配制
准确称取10.0 mg肌苷酸标准品，用5%(v/v)的甲醇水溶液定容到10 mL，溶液质量浓度为1.0 g/L，作为标准储备液放入4℃冰箱备用。

临用前用5%的甲醇水溶液逐级稀释，得到1.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100.0和120.0 mg/L的系列标准工作液。

1.3 样品处理
取一定量的烟熏鲣鱼样品，先用刨床刨成薄片状，再用均质器充分均质，然后放入4℃冰箱中保存。

在使用时样品用四分法取样。

纯水提取:称取烟熏鲣鱼样品2.50 g，放入200 mL烧杯中，加入90 mL 95℃的水，随后，将烧杯放入恒温水浴中，保持水温在95℃，蒸煮5 min后，用滤纸过滤，冷却到室温后定容到100 mL。

溶液采用0.45 μm滤膜过滤后进样分析，外标法定量。

高氯酸提取:称取烟熏鲣鱼样品2.50 g于50 mL塑料离心管中，加入6%(v/v)的高氯酸溶液20 mL，在漩涡振荡仪上振荡提取5 min，8 000 r/min离心5 min，倒入100 mL容量瓶中。

再用20 mL高氯酸溶液重复上述步骤。

用4 g/L的NaOH 中和高氯酸，并将pH调至6.5左右，定容到100 mL。

溶液采用0.45 μm滤膜过滤后进样分析，外标法定量。

1.4 色谱条件
色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇-50 mmol/L乙酸铵水溶液(5∶95，v/v);柱温为30℃;流速为1.0 mL/min;如未做特殊说明，进样量均为10 μL;检测波长为254 nm。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件的选择
采用文献［11］报道的甲醇-50 mmol/L乙酸铵作为流动相，在依利特Hypersil-NH2上分离肌苷酸，峰形不好，有拖尾现象，且峰形较宽(图1a)。

因此，本研究
更换色谱柱为 Agilent Zorbax SB-C18柱，保持流动相甲醇-50 mmol/L乙酸铵
不变，分离肌苷酸。

如图1b所示，肌苷酸标准品出峰时间为3.028 min(峰1)，
峰形较尖锐，未拖尾。

图1c为烟熏鲣鱼的纯水提取物，可看出肌苷酸峰形较好，未出现杂质峰，满足定量分析的需要。

2.2 提取条件的优化
采用纯水作为提取剂，影响其提取效率的因素包括提取时间和提取温度。

因此，本研究中考察了提取时间和提取温度对烟熏鲣鱼中肌苷酸提取效率的影响。

提取参数的考察均以HPLC测定烟熏鲣鱼中肌苷酸的提取浓度为评价指标，每个参数平行
测定2次。

图1 肌苷酸标准溶液和烟熏鲣鱼提取物的色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of inosinic acid standard solution and the extract from Smoked Katsuwonus pelamis samplea.standard solution on the Hypersil-NH2column;b.standard solution on the Zorbax SB-C18 column;c.the extract on the Zorbax SB-C18 column.Peak identification:1.inosinic acid.
2.2.1 提取时间的优化
样品中的待提取成分向溶剂中扩散的程度与提取时间有关，提取时间越长，越有利于待提取成分从样品扩散到提取溶剂中。

本研究以纯水为提取溶液，保持一定的温度，分别对2、5、10、20、30 min等不同提取时间进行了考察，平行测定两次，测得肌苷酸的平均含量分别为7.204、7.682、6.658、5.815、5.622 g/kg。

表明当提取时间为5 min时，提取效率最高;而当提取时间大于5 min时，提取效率反而下降，这是因为提取时间越长，肌苷酸发生热降解的几率越大［8］。

因此，本
实验选择提取时间为5 min。

2.2.2 提取温度的优化
随着温度升高，溶剂对提取物质的溶解度也在一定范围内增大，同时溶剂分子的运动速度也加快，溶剂对样品的浸润穿透也随之加快。

本研究对35、45、55、65、75、85、95℃等不同提取温度进行了考察，平行测定两次，测得肌苷酸的平均含
量分别为5.430、5.901、6.327、6.954、7.044、7.320、7.656 g/kg。

表明温度对提取效率的影响较大，在35℃时，提取的肌苷酸含量较低。

随着温度的增加，
提取效率逐渐增加。

在95℃的条件下，提取效率最高。

因此，实验采取95℃作为提取的最佳温度条件。

2.3 方法的性能指标
2.3.1 线性关系
分别测定肌苷酸系列标准工作溶液，以相应的色谱峰面积(y)对其质量浓度(x，
mg/L)进行线性回归。

肌苷酸在质量浓度1.0～120.0 mg/L范围内线性关系良好，其线性方程为 y=10.005 7 x－7.334 6，r2=0.999 8。

2.3.2 检出限与定量限
将肌苷酸配制成相应浓度，进样5 μL。

当信噪比(S/N)=3时，方法检出限为0.1 mg/L;当S/N =10时，方法的定量限为0.3 mg/L。

此时定容体积为100 mL，固体试样称样量为2.50 g，则该方法的检出限为4 mg/kg，定量限为12 mg/kg。

2.3.3 精密度和回收率
按照上述纯水提取的最优前处理条件和色谱条件，分别添加肌苷酸标准品为0.40、2.00、4.00 g/kg的低、中、高3个水平，平行测定3次烟熏鲣鱼样品，测定出的回收率结果见表1，回收率范围为84.6%～100.2%，相对标准偏差(RSD)范围为1.00%～6.12%，可见该方法精密度和重现性较好，可以满足烟熏鲣鱼中肌苷酸的检测需要。

表1 烟熏鲣鱼样品中肌苷酸的回收率及其RSD(n=3)Table 1 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of inosinic acid spiked in the Smoked Katsuwonus pelamis(n=3)?
2.4 两种前处理方法的比较
采用1.3节所述两种前处理方法提取另一批次烟熏鲣鱼中的肌苷酸，各测量5组数据，结果见表2。

从表2可以看出，以纯水作为提取液，测定的烟熏鲣鱼中肌苷酸的含量为1.48 g/kg，而以高氯酸作为提取液，测定的含量为1.08 g/kg，纯水的提取效率比高氯酸的提取效率要高37.0%。

由此可见，纯水提取肌苷酸的效率要
高于高氯酸提取。

表2 采用不同提取方法得到的烟熏鲣鱼中肌苷酸的含量(n=5)Table 2 Contents
of inosinic acid in Smoked Katsuwonus pelamis by different extraction methods(n=5)?
3 结论
本研究采用95℃的纯水提取烟熏鲣鱼中的肌苷酸，并用HPLC进行定性和定量分析。

在最优的色谱条件下，样品中的肌苷酸与杂质能够得到很好分离，且峰形较好，无拖尾现象。

该方法具有较高的灵敏度。

与高氯酸提取方法相比，提取效率增加了37.0%，并且该方法操作安全、与环境友好，对烟熏鲣鱼中肌苷酸的含量测定准确度良好，对其他食品中肌苷酸含量的测定具有借鉴意义，是一种值得推广的样品预处理方法。

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