核酸的组成与理化性质

NH2
OH
N
N
N
N
N
N
NN HOCH2 O
HH
H2N N N HOCH2 O
HH
H
H
H
H
OH OH
OH OH
腺嘌呤核苷 鸟嘌呤核苷
HO N HOCH2 O
HH
HO N HOCH2 O
HH
H
H
H
H
OH OH
OH OH
胞嘧啶核苷
尿嘧啶核苷
3、核苷酸的解离
O
O
pK1=0.7~1.6
R O P OH
R O P O-
酯键
酯键
NH2
N
N
O
5'
N
9 N
HO P O CH2 O-
O
1'
HH
H 2'
H
糖苷键
OH OH
腺苷酸
（二）碱水解
HOH 2C
O
base
-
RNA
OH
水解
H
H
H
H
O
O
P
O
OH
环磷酸酯
2′-核苷酸 3′-核苷酸
混合物
RNA
RNA的磷酸酯键易被碱水解→2’-或3’-核苷酸 DNA对稀碱稳定,因为没有2’-OH；
或40 μ g/ml单链DNA（或RNA） 或20 μ g/ml寡核苷酸
220 260
300
/nm
3 判断DNA是否变性：
核酸溶液的紫外吸收可以用摩尔磷吸光系数 (p)来表示， 测定核酸的 (p)可判断DNA制剂是否发生变性或降解。
(p): 摩尔磷吸光系数
(p)

A
CL
A：样品的光吸收值 C：每升溶液中磷的摩尔数 L：比色杯内径
核酸分子细长，溶液的粘度很大，且DNA溶液 的粘度比RNA的大得多。发生变性或降解时， 它们的粘度降低。
一般而言DNA比RNA稳定。
二、核酸的酸碱性质
由于核苷酸含有磷酸与碱基，为两性电介质，但偏于酸性。 它们在不同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成 兼性离子。
在某一pH的溶液中，两性电解质所带净电荷为零，此时溶液 的pH称为等电点（pI）。对于核苷酸来说，当带负电荷的磷 酸基正好与带正电荷的含氮环数目相等时的pH，即为核苷酸 的等电点。
闭合DNA构型紧密，空间位阻最小，所以跑得最 快，而开环DNA空间位阻最大，所以跑得最慢。
二、核酸的水解
（一）酸水解 顾名思义，在酸性条件下水解； 糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解，但糖苷键比磷酸酯键 更易被酸水解； 嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定
（更易水解）嘌呤碱的糖苷键﹥嘧啶碱的糖苷键﹥磷酸
I从pH6.9用 酸或碱正向 滴定
II从pH12或 pH2.5分别反向 滴定
DNA分子内部的氢键的 变化，碱基的暴露
核酸的凝胶电泳
在中性或偏碱缓冲液中，核酸解离成阴离子，在电场 中向阳极移动。 迁移率与核酸的大小和构象有关，可用于核酸的分离、 鉴定
溴化乙啶染色
简单介绍 琼脂糖凝胶电泳技术
提取出来的质粒跑电泳胶 经常有1-3条带 单酶切
经验式: (G-C)%=(Tm-69.3)×2.44
(3)介质中的离子强度 一般在较高的离子强度时（起 着中和电荷作用，从而稳定DNA），DNA的Tm值较高， 而且熔解过程发生在一个较小的温度范围之内。
宿主控制的限制与修饰现象 由两种酶活性配合完成的， 一种叫修饰的甲基转移酶， 另一种叫核酸内切限制酶。
限制酶的分类
根据限制酶的结构，辅因子的需求，切割位点与作用方式等，可 分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，同时具有修饰及认知切割的作用。其 中I类限制性内切酶通常其切割位点距离识别位点可达数千个碱基 的距离，如：EcoB，EcoK。Ⅲ类限制性内切酶可识别短的不对称序 列，切割位点与识别位点通常距20多个碱基对，如EcoPI。Ⅰ类和 Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。
双酶切
线性质粒DNA，即环状双链DNA 两条链均断裂，linear DNA。
质粒DNA中有一条链发生一处或 多处断裂，形成松弛的环状分子 ，称为开环DNA，open circular DNA，简称ocDNA
质粒的两条链没有断裂，形成超 螺旋，叫共价闭合环状质粒DNA （covalently closed circular DNA，简称cccDNA，或super coil DNA）
只作用RNA，不作用于DNA； 十分耐热； 具有极高专一性的内切酶，其作用位点为嘧啶核苷 （Py）-3`-磷酸与其他核苷酸之间的连接键； 产物是3`嘧啶核苷酸结尾。
当然，有不少核糖核酸酶通常不能识别RNA的 序列。
如Argonaute 蛋白，在RNA的特定位点进行切 割，并常需要小RNA（small RNA）的帮助
（3）其它，双链酶，单链酶等
1、磷酸二酯酶（非特异性核酸外切酶）
牛脾磷酸二酯酶
蛇毒磷酸二酯酶
识别5’末端
识别3’末端
水解DNA（RNA） 得3’-核苷酸
水解DNA（RNA） 得5’-核苷酸
OH
2.核糖核酸酶类（RNase）
(1)牛胰核糖核酸酶 （pancreatic ribonuclease, 简称RNase A或RNase I）
1、碱基的解离
碱基中杂环分子中的N
具有结合和释放质子的
能力，既有碱性解离又
C
有酸性解离.而环外的
氨基的碱性很弱，在生
理条件下不能质子化。
A
2、核苷的解离
糖环的存在影响了碱基的解离： 增强了碱基的酸性解离，即增强了碱基上可解离基 团的酸性。 核糖中羟基解离的pK值通常性质与其解离状 态相关，而解离状态又与pH有关。所以 ，溶液的pH范围直接影响核酸结构中碱 基对间的稳定性。对于DNA，在pH4-11之 间为稳定，超越此范围，DNA将变性。
正滴定曲线I的非缓冲区较宽； 逆滴定曲线II的非缓冲区较窄；
两条曲线不能重合，反映出天然DNA与 变性DNA的滴定曲线是不同的。
3．脱氧核糖核酸酶类
(1)牛胰脱氧核糖核酸酶（DNasel) ：此内切酶切断双链 DNA或单链DNA成为以5’-磷酸为末端的寡聚核苷酸，平 均长度4nt，需镁离子(或Mn2+，Co2+)，最适pH 7-8。
PPPPPPP P
(2)牛脾脱氧核糖核酸酶（DNaseⅡ) ：降解DNA成为3’磷酸末端的寡聚核苷酸，平均长度6nt。最适pH 4～5， 需0.3 mol／L钠离子激活，镁离子可以抑制此酶。
检测核酸和核苷酸。（蛋白质在280nm 有一吸收峰）
1 判断核酸样品的纯度。
纯DNA 纯RNA
A260/A280值>1.8（实验中通常（1.65-1.85） ） A260/A280值=2.0
若含有杂蛋白等，则A260/A280比值明显降低。
A260
2 定量测定核酸纯品：
对于纯的样品，只要读出260nm的A值即可算出含量。 A260=1, 相当于50μ g/ml双螺旋DNA
OH OH
+
CMP
NH 2
±
CMP
N
pICMP =
pKa1+pKa2 2
=
0.8+4.5 2
= 2.65
NH 2 N
pKa2=4.5
O
ON
HO P O CH2 O
O-
HH
H
H
OH OH
CMP-
pKa3=6.4
O -
ON
O P O CH2 O
O-
HH
H
H
OH OH
CMP--
多核苷酸中磷酸二酯键中的磷酸基团只 有一个解离常数
Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶，只具有认知切割的作用 ，修饰作用由其它蛋白执行。所识别的位点多为短的回文序列， 所切割序列常即为识别位点。这种限制性内切酶在分子克隆中得 到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。
Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
a. 具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序,在特定位点切割DNA分子 b. 产物具有黏性末端或平整末端
（三）酶水解
水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶； 核酸酶的分类
(1)按底物专一性分 非特异性核酸酶:作用于DNA和RNA 核糖核酸酶(RNase)：作用于RNA 脱氧核糖核酸酶(DNase)：作用于DNA
(2)按切割位点分 核酸内切酶(endonuclease) 核酸外切酶(exonuclease) 既可内切，也能外切的核酸酶
OH
OH
O
pK2=5.9~6.5
R O P O-
O由于磷酸基的存在，核苷酸具有较强的酸性。
碱性：来自于碱基，较弱 酸性：来自于碱基和磷酸
胞嘧啶核苷酸的解离
NH 2 + HN
NH 2 + HN
O
ON
O
ON
HO P O CH2 O
OH
HH
pKa1=0.80 HO
P O CH2 O
O-
HH
H
H
H
H
OH OH
将DNA溶液进行加热变性过程中 ，使DNA的双螺旋结构失去一半 （A260达到最大值的50%）时的 温度称为该DNA的熔点，用Tm表 示。DNA的Tm值一般在82—95℃ 之间
影响Tm值的因素
(1) DNA的均一性 均一性愈 高的样品，变性过程的温度 范围愈小。
(2) G-C之含量 。因为GC对 含3个氢键，AT对含2个氢键 ，故G-C对相对含量愈高， Tm 亦愈高
DNA的紫外吸收光谱
核苷酸﹥变性DNA﹥天然DNA
五、核酸的变性、复性及杂交
（一）变性(denaturation) 核酸的变性是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键 及碱基堆积力的破坏，变成单链结构的过程。 核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级 结构(碱基顺序)保持不变。
骤然 冷却
核酸变性特征
应用于 克隆、 测序、 检测 DNA等
讨论 质粒的构建
四、 核酸的紫外吸收
由于碱基具有共轭双键体系，使核酸在260-290nm波长范 围内有独特的紫外吸收，最大吸收峰在260nm附近。核酸 的紫外吸收是核酸定量测定的基础。
OD260的应用
核酸在260nm 附近有最大吸收值，据此特性可定性和定量
迁移率与核酸的大小和构象有关可用于核酸的分离鉴定溴化乙啶染色核酸的凝胶电泳简单介绍琼脂糖凝胶电泳技术提取出来的质粒跑电泳胶经常有13条带质粒的两条链没有断裂形成超螺旋叫共价闭合环状质粒dnacovalentlyclosedcirculardna简称cccdna或supercoildna质粒dna中有一条链发生一处或多处断裂形成松弛的环状分子称为开环dnaopencirculardna简称ocdna线性质粒dna即环状双链dna两条链均断裂lineardna
由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸 ，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的 等电点比较低。
pI DNA：约为 4.0 ~ 4.5 RNA：约为 2.0 ~ 2.5
RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核 糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的 解离。DNA没有这种作用。
4、核酸的滴定曲线 小牛胸腺DNA的滴定曲线
限制性内切酶的命名
限制酶的命名：
EcoRI
Eco R I
属名 菌株
种名
编号
第一位： E为大肠杆菌E. coli属名的第一个字母， 第二、三位：种名的头两个字母co 第四位： 菌株R 第五位： 罗马字，从该细菌中分离出来
的这一类酶的编号。
HindⅢ 流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）
核酸的理化性质及DNA纳米技术
朱德裕
主要内容
一、一般理化性质 二、核酸的酸碱性质（磷酸基，碱基） 三、核酸的水解（糖苷键，磷酸二酯键） 四、核酸的紫外吸收（碱基） 五、核酸的变性、复性与分子杂交 六、DNA纳米技术
一、一般物理性质
DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固 体。均微溶于水，其钠盐易溶于水。不溶于 一般有机溶剂。
每升中磷的重量( g ) W C 磷的原子量( 30.89)
核苷酸﹥单链﹥双螺旋； RNA﹥DNA； 核酸的光吸收比其各核苷酸成分的光吸收值之和要少30％－40％， 这是双螺旋中碱基紧密堆积在一起造成的。
在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应，这是因为 双螺旋结构使碱基对的π 电子云发生重叠，因而减少了对紫外光 的吸收）； 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数又减小（减色效应）。
PPPPPPP P P
(3) DNA限制性内切酶（restriction endonuclease ）
主要来源于细菌，功能是降解外源的DNA，不降解自身细胞的 DNA。因为它们自己的DNA在自身相应位点上经甲基化修饰而受 到保护。
在大肠杆菌K菌株上生长 的λ噬体则表示为λ(K)。用 这种λ(K)噬菌体感染大肠 杆菌B菌株，形成噬菌斑 的效率就很低，称为限制 。但用这些变化了的λ(B) 噬菌体再感染B菌株，它 们就可以在B菌株上有效 地生长，称之为修饰。无 论是限制还是修饰，都是 由宿主控制的，我们统称 为宿主控制的限制与修饰 现象。
（1）热变性
AT区先解链 GC区后解链
DNA的变性过程是突变 性的，它在很窄的温度 区间内完成。
当DNA的稀盐溶液加热 到80-100℃时，双螺旋 结构即发生解体，两条 链彼此分开，形成无规 线团。
螺旋双链 一半解开
螺旋双链开始 局部分开
DNA热变性曲线
Tm值
与其它有机固体物质类似，DNA分子也有特定“熔点”。
OD260增高（增色效应） 粘度下降 沉降系数和浮力密度增加（变性聚集） 旋光偏振光改变 酸碱滴定曲线改变 生物活性部分或全部丧失
RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有 DNA那样明显。
引起核酸变性的因素
（1）温度；加热到80～100℃ （热变性） （2）pH改变 （3）化学试剂：尿素 、甲醛 （4）离子强度 （5）其它理化因素：紫外线、X射线及荧光染料处 理等