16S rDNA基因的PCR扩增
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1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣 获1993年度诺贝尔化学奖。
生物样品 DNA片段
基 基 基 法人 因 因 因 医类 诊 治 工 学学 断 疗 程 检研
产 测究 品
……
基因组DNA
获取特定DNA片段 扩 增 特 定 片 段
第2轮结束
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
PCR反应条件
第PC3R轮过程扩增
PCR的特点
PCR的基本原理
第4轮扩增 第5轮扩增
第6轮扩增
我们实验的反应体系
10×Taq聚合酶反应缓冲液2.5μL dNTP(20mmol/L)2μL 5’端引物（25pmol/μL）1μL 3’端引物（25pmol/μL）1μL 菌体DNA（约50ng/μL）1μL Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5μL H2O 补足总体积25μL
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程 PCR的特点
95℃
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理 Taq
PPCCRR反过应程条件95℃
PCR的特点
Taq
50℃
Taq
72℃
Taq
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
合成引物
RNA引物
RNA引物
5引‘ A物UC酶GCG
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
形 成
条变
单性
链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件95℃
PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1971年，Khorana提出：经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶 延伸引物，并不断重复该过程便可 克隆tRNA基因。
但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制
最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
反应条件为：首轮循环94℃变性2min；再接 94℃30s，50℃30s，72℃1min，30个循环； 最后72℃延伸20min。
取5ul反应液,1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增 结果
耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循 环仪
1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCT
DNA GGAUCG
聚合酶
5‘
合成引物
5‘AUCGCG A聚DT合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u
1.5mmol/L
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22DNA 2DNA Nhomakorabea4℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 性 60
40 20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
(%)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
形 成
条变
单性
链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件50℃
PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
生物样品 DNA片段
基 基 基 法人 因 因 因 医类 诊 治 工 学学 断 疗 程 检研
产 测究 品
……
基因组DNA
获取特定DNA片段 扩 增 特 定 片 段
第2轮结束
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
PCR反应条件
第PC3R轮过程扩增
PCR的特点
PCR的基本原理
第4轮扩增 第5轮扩增
第6轮扩增
我们实验的反应体系
10×Taq聚合酶反应缓冲液2.5μL dNTP(20mmol/L)2μL 5’端引物（25pmol/μL）1μL 3’端引物（25pmol/μL）1μL 菌体DNA（约50ng/μL）1μL Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5μL H2O 补足总体积25μL
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
PCR反应条件
PCR过程 PCR的特点
95℃
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理 Taq
PPCCRR反过应程条件95℃
PCR的特点
Taq
50℃
Taq
72℃
Taq
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
合成引物
RNA引物
RNA引物
5引‘ A物UC酶GCG
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
形 成
条变
单性
链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件95℃
PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
3’
5’
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1971年，Khorana提出：经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶 延伸引物，并不断重复该过程便可 克隆tRNA基因。
但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制
最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
反应条件为：首轮循环94℃变性2min；再接 94℃30s，50℃30s，72℃1min，30个循环； 最后72℃延伸20min。
取5ul反应液,1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增 结果
耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行， 随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循 环仪
1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCT
DNA GGAUCG
聚合酶
5‘
合成引物
5‘AUCGCG A聚DT合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+
各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u
1.5mmol/L
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22DNA 2DNA Nhomakorabea4℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 性 60
40 20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
(%)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
形 成
条变
单性
链
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件50℃
PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点