全反式维甲酸对食管癌KYSE70细胞增殖、迁移及Notch1、DLL4、VEGF-C表达的影响

全反式维甲酸对食管癌KYSE70细胞增殖、迁移及Notch1、
DLL4、VEGF-C表达的影响
桑露倩;李娜;王映;都小晗;路颜娟;路太英
【摘要】目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)单独及联合维甲酸受体β(RARβ)激动剂
CD2314或抑制剂LE135对食管癌KYSE70细胞增殖、迁移的影响以及可能机制.
方法:将KYSE70细胞分为ATRA组、ATRA+CD2314组、ATRA+LE135组和对
照组,采用CCK-8法检测各组细胞分别处理24、48、72 h的增殖情况,通过划痕实验测定处理24 h后的迁移能力,采用Western blot方法检测处理48 h后各组细
胞Notch1、DLL4和VEGF-C蛋白的表达情况.结果:处理24、48和72 h
后,ATRA+CD2314组细胞增殖抑制率高于ATRA组,ATRA+LE135组低于ATRA
组(P<0.05);处理24 h后,ATRA组细胞的迁移能力低于对照组,ATRA+CD2314组
细胞的迁移能力低于ATRA组(P<0.05),而ATRA+LE135组高于ATRA组
(P<0.05);处理48 h后,ATRA组细胞Notch1蛋白表达量高于对照组,DLL4和VEGF-C蛋白表达量低于对照组,ATRA+CD2314组细胞Notch1蛋白表达量高于ATRA组,而DLL4和VEGF-C蛋白的表达量低于ATRA组;ATRA+LE135组细胞Notch1蛋白表达量低于ATRA组,DLL4和VEGF-C蛋白表达量高于ATRA组
(P<0.05).结论:ATRA可能通过上调Notch1蛋白,下调DLL4、VEGF-C蛋白的表
达抑制KYSE70细胞增殖和迁移,增强RARβ的表达可进一步增强这一作用.
【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2018(053)004
【总页数】5页(P405-409)
【关键词】全反式维甲酸;增殖;迁移;Notch1;DLL4;血管内皮生长因子-C;食管癌【作者】桑露倩;李娜;王映;都小晗;路颜娟;路太英
【作者单位】郑州大学第一附属医院肿瘤科郑州450052;郑州大学第一附属医院肿瘤科郑州450052;郑州大学第一附属医院肿瘤科郑州450052;郑州大学第一附属医院肿瘤科郑州450052;郑州大学第一附属医院肿瘤科郑州450052;郑州大学第一附属医院肿瘤科郑州450052
【正文语种】中文
【中图分类】R735.1
食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,居世界癌症相关死亡原因的第6位，在中国排名第4位[1-2]。

目前食管癌的治疗包括手术切除、放疗和化疗，但其总生存率<10%，5 a生存率仍<25%[3]。

复发转移是导致死亡的主要原因，然而转移性扩散的分子机制尚不清楚。

研究[4-5]表明，恶性肿瘤的侵袭转移主要与肿瘤新生微血管和淋巴管的形成有关。

Notch信号通路在血管发生发展的多个方面起重要调控功能[6]，DLL4-Notch信号通路在调控血管生成、发育过程中扮演着重要角色[7]。

血管内皮生长因子-C(VEGF-C)是首先被发现的淋巴管生成因子，通过与血管内皮生长因子受体(VEGFR)3结合，刺激淋巴管内皮细胞的增殖和迁移，促进实体瘤内淋巴管的新生以及肿瘤细胞通过淋巴系统向全身扩散[8-9]。

全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是一种天然的维生素A衍生物，不仅参与胚胎发育和细胞生长分化，而且与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡和血管生成等密切相关，已用于多种肿瘤的治疗[10]。

这一过程必须依赖于ATRA与其特异性受体相结合。

维甲酸受体β(retinoic acid receptor β, RARβ)是最重要的维甲酸类受体，其作为
肿瘤抑制基因，在食管鳞癌的发生发展过程发挥重要作用[11]。

该研究观察了ATRA单独及联合RARβ激动剂CD2314或抑制剂LE135对食管癌KYSE70细胞增殖、迁移以及Notch1、DLL4、VEGF-C蛋白表达的影响，探索ATRA抗食管
癌微血管和淋巴管生成的可能机制，为食管癌的抗微血管和淋巴管治疗提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料 KYSE70细胞由郑州大学基础医学院肿瘤实验室赠送。

RPMI 1640培养基、DMSO为北京索莱宝科技有限公司产品。

胎牛血清为杭州四季青公司产品。

ATRA(用无水乙醇制成1 mmol/L的储备液，4 ℃避光保存)、LE135(用无水乙醇
制成10 mmol/L的储备液,-20 ℃保存)均购自Sigma公司，CD2314(用无水乙醇制成10 mmol/L的储备液,-20 ℃保存)购自Apexbio公司，CCK-8试剂为日本同仁公司产品。

兔抗人Notch1、DLL4、β-actin抗体购自美国Abcam公司，兔抗人VEGF-C抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 细胞培养及分组 KYSE70细胞单层贴壁生长于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中常规培养。

将KYSE70细胞分为4组：ATRA组(ATRA终浓度为10 μmol/L)、ATRA+CD2314组(ATRA终浓度为10 μmol/L、CD2314终浓度为1 μmol/L)、ATRA+LE135组(ATRA终浓度为10 μmol/L、LE135终浓度为1 μmol/L)和对照组(不加药物处理)。

1.3 CCK-8法检测各组细胞的增殖将KYSE70细胞接种于96孔板，每孔5 000个，过夜培养，待贴壁后，按1.2分组培养，同时设调零孔(只有培养液)，每组设
6个平行孔。

分别培养24、48、72 h后，CCK-8法测细胞增殖情况。

每孔加入CCK-8试剂(5 g/L)10 μL，孵育1～2 h后，选择450 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定光密度(OD)值。

然后按[(OD对照组-OD实验组)/(OD对照组-OD调零孔)]×100%计算细胞增殖抑制率。

实验重复3次。

1.4 划痕实验检测各组细胞的迁移能力 KYSE70细胞接种于6孔板中，5×105个/孔，每孔加2 mL含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，培养24 h，
用无菌枪头沿孔板中央划一条直线，按1.2分组培养，每组设3个平行孔。

分别在0、24 h 拍照，用图像处理软件测量划痕宽度，迁移率=(0 h的划痕宽度-24 h的划痕宽度)/0 h的划痕宽度×100%。

实验重复3次。

1.5 Western blot检测各组细胞中Notch1、DLL4及VEGF-C 蛋白的表达
KYSE70细胞接种于6孔板，过夜培养后，按1.2分组培养48 h，提取各组细胞
总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。

配制体积分数为10%的分离胶和体积分数为5%
的浓缩胶，上样，蛋白电泳、转膜、封闭，加入兔抗人Notch1、DLL4及VEGF-
C 抗体一抗(按11 000稀释)及β-actin单克隆一抗(按11 000稀释)，4 ℃孵育过夜。

次日取出膜片，于TBST溶液中洗涤3次，每次5 min，分别加入HRP标记
的二抗(按12 000稀释)室温、水平摇床上孵育1 h，暗室ECL发光液发光、显影
及定影。

以目的蛋白与内参条带灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量。

实验重复3次。

1.6 统计学处理采用GraphPad Prism6进行数据分析。

采用单因素方差分析比较各组细胞增殖抑制率，迁移率及Notch1、DLL4、VEGF-C蛋白表达的差异。

检
验水准α=0.05。

2 结果
2.1 各组细胞增殖能力比较见表1。

随着药物作用时间的延长，3个药物组细胞增殖抑制率均逐渐上升；与ATRA组相比，ATRA+CD2314组细胞增殖抑制率升高，ATRA+LE135组细胞增殖抑制率降低。

表1 各组KYSE70细胞的增殖抑制率(n=3) %组别24 h48 h72 hATRA+LE135组24.39±1.43#30.83±1.57#40.46±1.64#ATRA组
29.04±1.3940.29±1.5951.49±1.21 ATRA+CD2314组
36.74±1.21#50.07±1.26#62.05±1.50# F218.215507.278718.410
P<0.001<0.001<0.001
#:与ATRA组相比，P<0.05
2.2 各组细胞迁移能力的变化各组处理24 h后细胞迁移情况见表2。

可知，ATRA组细胞迁移能力低于对照组；ATRA+CD2314组低于ATRA组，而ATRA+LE135组高于ATRA组。

表2 各组细胞迁移率及Notch1、DLL4、VEGF-C蛋白表达的比较(n=3)组别迁移率/%Notch1蛋白DLL4蛋白VEGF-C蛋白对照组74.45±0.491
321.69±29.68818.12±14.331 920.28±21.69 ATRA+LE135组57.74±0.47∗#1 174.89±59.93∗#1 045.87±46.50∗#2 069.13±25.23∗# ATRA组
42.65±0.98∗2 390.27±74.50∗673.84±15.11∗1 205.99±24.28∗
ATRA+CD2314组33.92±1.09∗#2
536.50±191.57∗#577.07±54.80∗#585.97±26.55∗#
F172.081249.089167.017651.899 P<0.001<0.001<0.001<0.001
*：与对照组相比，P<0.05；#：与ATRA组相比，P<0.05
2.3 各组细胞中Notch1、DLL4、VEGF-C蛋白表达的比较见表2、图1。

药物处理48 h后，ATRA组细胞Notch1蛋白表达量高于对照组，而DLL4和VEGF-C 蛋白表达量低于对照组；ATRA+CD2314组细胞Notch1蛋白表达量高于ATRA 组，而DLL4和VEGF-C蛋白表达量低于ATRA组；ATRA+LE135组细胞Notch1蛋白表达量低于ATRA组，DLL4和VEGF-C蛋白表达量高于ATRA组。

1：对照组；2：ATRA+LE135组：3：ATRA组；4：ATRA+CD2314组
图1 各组细胞中Notch1、DLL4、VEGF-C蛋白表达的比较
3 讨论
微血管和淋巴管的生成是恶性肿瘤侵袭转移的重要机制之一。

血管生成为肿瘤提供氧和营养物质，更为肿瘤的血行转移提供了条件。

研究[6]发现，在血管生成中起
重要作用的DLL4-Notch信号通路是有希望的肿瘤治疗新靶点之一。

Notch信号
通路是一种高度保守的信号传导途径[6]，与Shh、Wnt、Ras、EGFR、VEGF等
信号通路共同调节肿瘤的发生、发展[12]。

由于细胞环境的变化，Notch信号通
路在肿瘤的调节过程中具有致癌作用或抑癌作用的“双刃剑”效应[13]。

研究[14-16]表明，Notch受体和配体的异常表达以及Notch信号的异常激活与多种恶性
肿瘤的发生密切相关；其中Notch1作用显著，且在肿瘤相关试验中被广泛研究。

有研究[17]显示Notch1通路在食管鳞癌中是肿瘤抑制因子。

DLL4作为内皮细胞
中Notch唯一的特异性配体对于胚胎血管发育和动脉调节的发育十分重要[18]。

实验[19]表明在肿瘤中DLL4的上调与微血管和淋巴管生成密切相关。

VEGF-C是肿瘤血管生成、浸润和转移的关键因子，具有增强淋巴管生成的特殊功能[20]，与其受体VEGFR3结合后能诱导血管及淋巴管内皮细胞生长，促进肿瘤
转移。

研究[21]已证实VEGF-C过表达的食管癌患者预后不良。

ATRA作为目前研究最为深入、作用最强的分化诱导剂，通过诱导肿瘤细胞分化，逆转肿瘤细胞的生物学特征，已被用于多种肿瘤尤其是急性早幼粒细胞性白血病的治疗[22]。

已有研究[23-26]表明，ATRA不仅可激活细胞的凋亡信号通路，抑制
食管癌细胞的增殖和迁移，而且可降低食管癌细胞VEGF、PI3K、MMP-2等的表达以及VEGF信号转导途径中CD31、CD34和CD105的表达，并下调Ang-1、Ang-2、Tie-2、Flt-1和KDR等基因的表达水平，从而影响食管癌细胞中新生血
管的生成。

ATRA主要与视黄酸受体结合形成复合物，作用于相应的靶基因，发挥抗肿瘤作用。

RARβ是甲状腺/类固醇受体超家族成员的核转录调控因子。

据报道[27-28]，
RARβ基因的失活与多种实体肿瘤的发生密切相关。

我们之前的研究[29]已证明
RARβ在正常食管黏膜中的表达高于食管癌组织;在食管鳞癌的发生过程中RARβ
丢失明显，说明RARβ在食管黏膜癌变过程中起重要作用。

因此，增加RARβ的
表达可能会增强ATRA的抗肿瘤作用，甚至是逆转肿瘤分化的一个潜在的途径。

本实验结果表明：与对照相比，ATRA可抑制食管癌细胞增殖、降低细胞迁移能力，同时增强Notch1蛋白的表达，抑制DLL4和VEGF-C蛋白的表达。

相比单药ATRA，ATRA联合RARβ激动剂CD2314对食管癌细胞增殖和迁移能力的抑制作用更加显著；ATRA联合RARβ抑制剂LE135对食管癌细胞的抑制能力则较单药ATRA减弱。

综上所述，ATRA抑制KYSE70细胞增殖和迁移的作用可能是通过上调Notch1蛋白，下调DLL4、VEGF-C蛋白的表达来调节的，增强RARβ的表达可进一步增强这一作用。

该研究为探索ATRA抗肿瘤新生微血管和淋巴管的作用机制奠定了一
定的理论基础，为ATRA的临床应用提供更充分的理论依据。

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