采用Nested -PCR从田间和水稻植株上检测稻曲病菌

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2006,14(4):542~545
*基金项目：国家自然科学基金（30471021）资助；辽宁省自然科学基金（20032091）资助作者简介：周永力(1968~),博士,副研究员。

Email:<zhouyl@>.
**通讯作者。

Author for correspondence.研究员，博士，主要研究方向：水稻分子遗传学。

Email:<lizhk@>.收稿日期：2005-09-26接受日期：2005-12-14
·研究论文
·采用Nested -PCR 从田间和水稻植株上检测稻曲病菌*
周永力1,谢学文1,王疏2,潘雅姣1,刘小舟2,杨皓2,徐建龙1,黎志康1**
（1.中国农业科学院作物科学研究所农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程，
北京100081；2.辽宁省农业科学院植物保护研究所，
沈阳110161）摘要：采用稻曲病菌()的特异性引物，对从发病程度不同的稻田土样、水稻（）生殖生长初期
稻田浮萍(
ssp.)和水稻植株的DNA 进行Nested PCR 扩增，分析稻曲病菌在稻田的存在和在植株上的附着和侵染，
结果显示在稻田中稻曲病菌可以附着在浮萍上，从第一年种植水稻田块的土壤中未检测到稻曲病菌，但在稻田中的浮萍上可以检测到；水稻生殖生长初期剑叶的叶耳间已有稻曲病菌附着和侵染。

实验证明PCR 技术可以有效地检测田间稻曲病菌。

关键词：稻曲病菌();检测;Nested PCR
中图分类号:S182
文献标识码:A
文章编号:1006-1304(2006)04-0542-04
Detection of from Rice Field and Plants by Nested PCR
ZHOU Yong-li 1,XIE Xue-wen 1,,WANG Shu 2,Pan Ya-jiao 1,LIU Xiao-zhou 2,
YANG Hao 2,XU Jian-long 1,LI Zhi-kang 1
**
was detected by Nested PCR from the soil,duckweeds (
spp.)in rice field and tiller of rice ()plants.PCR detection indicated that was attached to the duckweeds,and it could be detected from the surface and inside of
sword leaf auricle.The
wasn't detected from the soil samples,but there was
on the duckweeds in the field where rice was
planted first year.The above results show that nested PCR is useful tools to detect the pathogen from field and
plants.
;detection;Nested PCR
稻曲病（
(Cooke)Tak.）是一
种重要的水稻真菌病害，病菌将稻粒转变成稻曲球,表面覆盖大量粉状、墨绿色厚垣孢子。

20世纪80年代以来,随着杂交水稻、籼粳交育成的高产品种的推广和相应增产措施的应用，稻曲病在我国由次要病
害上升为主要病害，目前遍及各主要水稻种植区。

稻曲病显著地降低水稻产量和稻米品质。

发病严重的年份，产量损失率达30%以上；并且加工出的稻米混有大量厚垣孢子，厚垣孢子含有微管蛋白抑制剂，对人体健康极为不利,家畜食用污染的谷物还能引起中毒(Nakamura .,1994)。

20世纪50年代日本最早开始研究稻曲病的侵染时期和侵染途径，目前普遍认为稻曲病为单循环
病害，病菌主要以厚垣孢子在土壤中越冬,在水稻生
长季节，稻田水中的厚垣孢子萌发产生分生孢子侵染水稻。

然而由于稻曲病为穗部病害，稻曲病菌生活史比较复杂，迄今稻曲病发生规律中的一些关键问题尚不清楚。

在前期研究中，我们系统测定、比较了稻曲病菌及其同属近缘真菌rRNA 、ITS1、rRNA 和ITS 的核酸序列，在此基础上，设计了特异性引物，建立了高度灵敏、可靠的稻曲病菌Nested PCR 检测方法（Zhou ,2003），2003~2005年，在
辽宁稻区和北京昌平取样，
采用Nestea PCR 技术初步分析了稻曲病菌在田间和水稻植株上的分布。

1材料和方法
第4期周永力等:采用Nested-PCR从田间和水稻植株上检测稻曲病菌
1.1标样采集
2004年10月中旬水稻()收割后，从北京中国农业科学院作物科学研究所昌平基地的稻田、与稻田相邻的豆田采集表层土样，按平行线跳跃取样法每块田各取30份土样，于50℃烘干备用。

2005年7月8~20日，每隔5~7d在昌平基地稻田中取漂浮在稻田水面的浮萍（spp.），每块田随机取3点，冷冻抽干后保存于－20℃备用。

2003和2004年8月初于水稻生殖生长期在沈阳东陵区汪家乡稻田取样，分别剪取处于不同发育阶段的剑叶叶耳间，以及破口期和抽穗期幼穗，保存于-20℃备用。

1.2DNA提取
称取5mg冻干的植株标样和0.5g冻干的浮萍，采用Nakada.(1994)的方法提取DNA；称取0.3g烘干的土样，采用Volossious.(1995)的方法从土壤中提取DNA。

DNA样品溶解于20μL TE 中，经琼脂糖凝胶电泳检测后保存于-20℃备用。

1.3PCR扩增
采用2对特异性引物Us1-5/US3-3(第一轮)和US2-5/US4-3（第二轮）进行PCR扩增反应，PCR反应体系和扩增反应参照Zhou(2003)的方法。

以灭菌双蒸水为阴性对照，以纯培养的稻曲病菌()DNA为阳性对照。

第二轮PCR以1μL第一轮PCR产物为模板。

1.4田间发病率调查
采用平行线跳跃取样法，每块田取9点，每点5穴，调查各穴的分蘖数和发病穗数，计算平均发病穗率。

2结果和分析
2.1PCR检测稻曲病菌的特异性
用于PCR检测的DNA是一种复杂的混合体，除可能含有稻曲病菌DNA外，还包括水稻（或水生浮萍）、附着在植株上的其它病原菌等。

PCR扩增结果表明，实验所用引物具有高度的特异性，第一轮PCR扩增之后，所有标样除少数标样有一条目标扩增片段产生之外，均无任何杂带产生(图1,A)；经第二轮PCR扩增出现目标扩增片段的样本数目较第一轮增加，检测的灵敏性显著提高(图1,B)，与第一轮PCR反应相同，除了目标扩增带外，所有的标样均无任何杂带产生，表明本检测方法具有高度的特异性。

2.2稻曲病菌在不同田块土壤表层的分布
1号、4号和5号田块为零星发病田，病穗率都低于1%，土样中检出稻曲病菌分别为13.3%、16.7%和3%（图2）；2号田块为稻曲病重发生田，2004年种植12个水稻品种，其中中粳优1号发病穗率为(75.69±17.51)%，优质1号和新稻10号的发病穗率分别为(68.27±25.76)%和(63.09±27.66)%，整块稻田的平均发病穗率(30.39±13.46)%。

上述结果表明，在上一季节稻曲病的重发生田、零星发病的轻病田都能检测到稻曲病菌，但是发病严重程度不同的田块检测到稻曲病菌的频率不同，重病田秋季水稻收获之后地表遗落了较多的厚垣孢子，30份土样中有26份可以检测稻曲病菌，阳性率为86.7%。

图1.Nested PCR检测剑叶稻曲病菌
Fig.1.Detection of from sword leaves by
Nested PCR
A.Simple PCR;
B.Nested PCR;CK,positive control;
1~15,samples;M,marker.
图2.稻曲病菌在不同田块的土壤中的分布
Fig.2.Detection of from soil samples in
different fields
从与稻曲病轻发生稻田相邻的下游豆田表土层土样中未检测到稻曲病菌，但是2005年种植在该地块的中作9052、新稻10号、垦育2号、津源17和优质1号5个水稻都有病穗产生，初步调查优质1号的病穗率为17%。

据推测，上述现象出现的原因，可能是豆田存在少量厚垣孢子，但是由于所取的取样点较少或所检测的土样量较少，未检测到稻曲病菌；另一种可能是本生长季节中上游稻田中的病菌随水流或气流进入到
稻田中。

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农业生物技术学报2006年
表1Nested PCR 检测生殖初期水稻剑叶和幼穗稻曲病菌的带菌率(辽宁,2003)Table 1Detection of
from sword leaves by Nested PCR （Liaoning,2003）
*,
<0.01
样本样本数PCR 阳性样本率/%PCR 阳性样本数Sample No.of samples Percentage of PCR No.of positive PCR samples
positive samples PCR Nested PCR 破口期幼穗
Spike at heading emerge stage 叶耳间长≥5cm
Auricula length of sword leaf ≥5cm 抽穗期幼穗
Spike of heading stage 叶耳间长≤5cm
Auricula length of sword leaf ≤5cm 37
44
22
36
94.59a*
45.45b
22.72bc
5.56c
3
35
20
5
2
2.3水稻生殖生长初期在稻田中的分布
在2005年水稻生长季节，
采集漂浮于稻曲病重病田（平均病穗率(30.39±13.46)%）、零星发病田和
重病田块下游田块（2004年种植大豆，2005年种植
水稻）水面的浮萍，提取DNA ，采用特异的嵌套引物
对US1-5/US3-3和US2-5/US4-3进行扩增，经第一轮PCR 扩增后轻病田1份样品有特异性带产生；第
二轮PCR 后，
来自3块稻田部分样品都有特异带产生（图3），即从3块田的浮萍上都能检测稻曲病菌，
这一结果表明，
在水稻的生长季节，稻曲病菌可以附着在水面的浮萍上，浮萍及其表面的肥料和分泌物可能为稻曲病菌厚垣孢子的萌发和生长提供了基质和营养。

从图3中可以看出第二轮扩增有特异带产生的样品，其目标片段的亮度不同，如7、12、14、15、19、22和31号样品的扩增带较弱，6号和10号样品比较亮，4号等样品的扩增带很亮，表明不同浮萍上附着稻曲病菌的数量不同。

田间观察发现，在采用相同田间管理的条件下，常年种植水稻的田块漂浮的浮萍量多，第一年种植水稻的田块漂浮的浮萍量最少，因此及时清除田间的浮萍可以有效地降低田间的菌源。

2.4水稻植株上出现稻曲病菌的频率
PCR 检测发现同一时间
所取的不同生育期分蘖，
其稻曲病菌的带菌率不同，剑叶与倒二叶间叶鞘长≥5cm 的样本带菌率显著高于剑叶与倒二叶间叶鞘长≤5cm 的样本，分别为5.56%和45.45%（表1）；破口期样本带菌率为94.59%，抽穗期样本带菌率为22.72%，显著低于破口期。

上述结果表明生殖生长期，尤其是破口期水稻植株上普遍存在稻曲病菌，由于本实验中DNA 是从田间取来的稻样直接提取获得，因而检测到的病菌可能包括附着在植株表面和侵入植株内部的病菌。

为进一步分析水稻生殖初期稻曲病菌在水稻植株上附着和侵染状况，对2004年的样品进行反复清洗，镜检确认样品表面无孢子后提取DNA ，通过
PCR 检测分析稻曲病菌的侵染率。

从表2可以看出，不同分蘖的剑叶与倒二叶间的叶鞘都有厚垣孢子附着，叶耳间长6和8cm 样本的厚垣孢子附着率
高于叶耳间长2和4cm 的样本，这一结果与2003年的样本相似；经第一轮PCR 扩增后叶耳间长2、4和6cm 的样本均无目标带产生，叶耳间长8cm 的样本有18个产生明亮的目标DNA 带（图4）；经第
二轮PCR 扩增后，叶耳间长2、4、6和8cm 样本的
PCR 阳性率分别为62.5%、25.0%、33.3%和94.7%。

图3.Nested PCR 检测不同田块的浮萍稻曲病菌Fig.3.Detection of from duckweeds samples in different fields by Nested PCR 1~3,10~12,19~21and 28~30,samples collected from 3rd field;4~6,13~15,22~24and 31~33,samples collected from 5th field;7~9,16~18,25~27and 34~35,samples collected from 2nd field (the field code was the same as Fig.2);CK,negative
control.
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第4期周永力等:采用Nested -PCR 从田间和水稻植株上检测稻曲病菌
表2PCR 检测水稻剑叶稻曲病菌
（北京,2004）Table 2Detection of
from sword leaves by PCR （Beijing,2004）
*,
<0.01
剑叶叶耳间长/cm 样本数附着厚垣孢子的样本数PCR 阳性样本百分率/%Auricula length No.of sample
Samples attached by chlamydospore Percentage of positive PCR samples of sword leaf Number %PCR Nested PCR 82641924212485108
42.120.847.633.3
94.7000
94.7a*62.5ab 33.3bc 25.0c
图4.PCR 检测水稻叶耳间长8cm 样本稻曲病菌Fig.4.Detection of
from auricula of
sword of 8cm by simple PCR
1~19,samples ;CK,negative control.
3讨论
近年来，分子生物学技术的发展为植物病害研究提供了新的手段。

核糖体ITS 区（rDNA internal transcribed spacers ）核酸序列具有鉴别真菌种的功
能，20世纪90年代以来，根据该区核酸序列设计特异性引物，采用PCR 技术能够从土壤、种子、收获的
果实以及植物体内特异性地检测到目标真
菌
(Moukhamedov .,1994;Tooley ,1997;
Terashima ,1997)；在医学上，已有的研究表明PCR 技术可以成功地用于监测霍乱等流行病病原物种群的动态变化，为病害的暴发流行提供有用的信息(Erin,,2003)。

稻曲病菌生长速度缓慢，由于环境中特别是稻田中微生物种类复杂，而且该病菌分生孢子和菌丝均无特异的形态特征，采用显微镜观察和分离培养等常规的植物病理学手段都难以鉴定。

长期以来，由于缺乏有效的检测方法，环境中稻曲病菌动态与病害发生之间的关系研究一直还是空白。

本研究通过Nested PCR 检测，发现第一年种植水稻的田块中存在稻曲病菌，秋季种植于该田块中的感病品种相应
地了出现病穗，
初步显示PCR 技术检测稻曲病菌的有效性。

此外，连续两年所取样品的检测结果表明从水稻生殖生长初期，植株上即有稻曲病菌附着；并且剑叶与倒二叶间的叶鞘内部带菌的样本率达20%以上，高于当年田间的发病穗率，据此，我们推测稻曲病菌可能从剑叶落入叶耳，但并不是全部都能有效生长。

目前我们正在建立稻曲病菌的Real-time PCR 体系，以定量地检测田间稻曲病菌的动态变化和进一步研究稻曲病菌的侵染规律，这方面的结果将为建立稻曲病发生的检测和预报体系提供有价值的信息。

参考文献
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545。