四重荧光定量RT-PCR检测人感染新型甲型禽流感H7N9病毒

四重荧光定量RT-PCR检测人感染新型甲型禽流感H7N9病
毒
王国政;崔大伟;谢国良;成军;孙长贵;李静云;金美彤;沈雄文;杨先知
【摘要】目的建立检测人感染新型甲型禽流感H7N9病毒的四重荧光定量RT-PCR方法.方法以人细胞RNA酶P(RNase P)基因为内参,用Primer Express3.0软件设计PCR特异性引物和探针.通过不同来源的呼吸道病毒进行特异性分析,构建质粒标准品用于分析该方法的灵敏度和重复性,并对1 896例临床标本进行回顾性检测.结果该方法检测甲型流感病毒(Flu A)、H7、N9与RNaseP灵敏度均达102 copies/mL,特异性达100％,每对引物和探针只检测出相应的病毒,无交叉反应,检测变异系数(CV)均低于1.55％.用该法检测1 896例临床标本,结果Flu A 235
例,H7N9 127例,与其他试剂报告结果完全一致.结论建立的四重荧光定量RT-PCR 法可快速检测H7N9病毒,灵敏度与特异性好,可用于H7N9病毒感染患者的早期诊断.
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2014(032)011
【总页数】5页(P801-805)
【关键词】甲型禽流感;H7N9;检测;RNA酶P;四重荧光定量PCR
【作者】王国政;崔大伟;谢国良;成军;孙长贵;李静云;金美彤;沈雄文;杨先知
【作者单位】浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;中国人民解放军第117医院检验科,杭州310013;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州
310003;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;中国人民解放军第
117医院检验科,杭州310013;中国人民解放军第117医院检验科,杭州310013;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;中国人民解放军第117医院检验科,杭州310013;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;中国人民解放
军第117医院检验科,杭州310013;浙江大学医学院附属第一医院检验科,杭州310003;中国人民解放军第117医院检验科,杭州310013;浙江大学医学院附属第
一医院检验科,杭州310003
【正文语种】中文
【中图分类】R446.5
甲型流感病毒(influenza A, Flu A)是单链RNA病毒，属于正黏病毒科。

依据其外膜血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白质抗原性不同[1-2]，目前可分为16个H亚型(H1～H16)和9个N亚型(N1～N9)[3-4]。

感染人的禽流感病毒亚型主要有
H5N1、H9N2、H7N2、H7N3、H7N7、H5N2、H10N7等[4-9]。

2013年2
月在我国上海、安徽首先发现一种新型高致病性H7N9禽流感病毒感染人的病例。

至2014年2月，已感染381病例，并致118例死亡[10-11]。

虽无人传染人的证据[12]，但因无针对该感染的相关疫苗，控制这种新型H7N9禽流感的爆发将是
一个挑战。

目前人感染H7N9禽流感的实验室检查包括病原学相关检测及胸部影像学检查等。

病原学检测是人感染H7N9禽流感病毒筛查和确认的重要环节，但病原分离培养
条件及技术要求高、周期长，不利于在常规实验室开展。

本研究建立检测H7N9
病毒的一步法四重荧光定量RT-PCR技术，为临床诊断提供一种有效、快速的检
测手段。

1.1 研究对象采集2013年3～12月浙江大学医学院附属第一医院发热门诊部分
标本，共1 896份。

另外，Flu A、H7N9细胞培养毒株和其他21种呼吸道病原
微生物[季节性H1N1、H3N2、新甲型H1N1(2009)病毒，乙型流感病毒，呼吸
道合胞病毒A和B型，麻疹病毒，肠道病毒EV71、肠道病毒CoxA16，肺炎支原体，肺炎克雷伯菌，鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，白念珠菌，禽流感H5N1、H5N3、H9N2病毒，人副流感病毒Ⅰ～Ⅲ型]由传染病诊治国家
重点实验室提供。

1.2 标本采集与处理用无菌咽拭子拭取鼻腔或咽部分泌物后，置内含2～3 mL灭
菌标本保存液的无菌管中，密闭送检。

1.3 试剂与仪器 QIAamp病毒RNA迷你试剂盒(德国Qiagen公司)，一步法荧光
定量RT-PCR试剂盒、质粒载体pMDTM19-T Simple Vector(日本TaKaRa公司)，ABI Prism7500荧光PCR检测系统(美国ABI公司)。

1.4 引物和探针设计从美国NCBI基因库下载涵盖国内外Flu A及甲型流感病毒
H7N9亚型的多条基因序列，用DNAman软件对其进行同源性比较，确定以上病毒基因组的保守区，用Primer Express 3.0软件在其保守区设计高度特异性的引
物与TaqMan探针，并进行BLAST序列比对验证引物特异性，同时根据引物设计优化原则，优化引物的Tm、GC含量等基本参数[13-14]。

引物和探针序列见表1，均委托上海生工公司合成。

1.5 病毒核酸的提取与标准品定量标准鼻咽拭子标本在标本运输(保存)液中充分搅动，洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等。

痰液等如黏液成分较重，可按1∶1体积比加入10 g/L pH 7.6的胰蛋白酶溶液，室温消化15～30 min。

吸取200 μL上清液加入EP管中，根据RNA提取试剂盒说明书进行提取，核酸样品最终洗脱体积为50 μL，用NanoDrop ND-2000核酸检测仪检测核酸纯度和浓度，-70 ℃保存。

合成各基因标准品片段，将其连接至质粒载体pMDTM19-T Simple Vector上进行转化和培养。

经鉴定后提取质粒DNA，利用NanoDrop ND-2000
核酸检测仪测量质粒DNA的浓度，确定DNA的拷贝数作为标准品定量母液。

根据实验需要，将标准品定量母液稀释至所需最高浓度，并连续10倍稀释至最低浓度，低温保存备用。

1.6 荧光定量RT-PCR反应体系和扩增条件通过试验优化配方[15]后配制一步法反应液。

体系包括2×RT-PCR反应液25 μL，TaKaRa Ex Taq HS(5 U/mL)1 μL，Prime Script Enzyme Mix Ⅱ1 μL，4种引物探针混合液(20 μmol/L，引物、探针比例为1∶1)各2 μL，样本RNA模板5 μL，去RNase水补足至50 μL。

扩增参数：50 ℃反转录30 min；95 ℃热启动5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s，在55 ℃进行四重荧光检测，共40个循环。

用ABI Prism 7500荧光PCR检测系统进行检测分析。

荧光标记的RNase P、Flu A、H7、N9探针以各自的Ct值按以下原则判断结果：①RNase P的Ct值≤35时，结果有效；RNase P的Ct值为40、0和无数值时，结果无效需重新采集标本或提取核酸。

②检测样本除RNase P外，其余Ct值为40、0和无数值时，报告为阴性。

③检测样本Flu A的Ct值≤35时，报告为甲型流感病毒阳性；若同时H7、N9的Ct值≤35，报告为甲型流感病毒H7N9亚型阳性。

④检测样本Ct值≥35且<40的样本，建议复检，复检结果Ct值<38者，依据③的判断标准报告为相应病毒阳性。

2.1 敏感性分析将Flu A、H7、N9和RNase P的合成片段(已标定拷贝数为107 copies/mL)分别10倍连续稀释后，用本方法检测，结果显示检测灵敏度均达102 copies/mL，见图1。

取实时荧光定量RT-PCR产物5 μL，120 V电压电泳20 min，凝胶成像系统拍照。

结果见图2。

2.2 特异性分析选择甲型流感病毒H7N9亚型的阳性核酸(均来自H7N9确诊患者标本核酸)和由传染病诊治国家重点实验室提供的其他呼吸道病原微生物，对该方法特异性进行验证，结果显示其检测甲型新型流感病毒H7N9与其他呼吸道病原体均无交叉反应。

该方法检出的H7N9禽流感病毒阳性结果见图3。

2.3 重复性(批内)试验分别取Flu A、H7、N9和RNase P的合成片段(终浓度均
为106 copies/mL)，按10倍连续稀释成3个不同的浓度，对每个浓度的样本重
复检测3次。

结果显示，不同浓度核酸各自的检测Ct值标准差在0.079～0.432
之间，变异系数(CV)均低于1.55%，具有较好的批内重复性。

见表2。

2.4 临床样本的检测分析用四重实时荧光定量RT-PCR对1 896例临床标本分析，该1 896例标本已用上海之江公司生产的人感染H7N9禽流感病毒RNA检测试
剂盒(荧光PCR法)进行过临床检测并报告临床。

本法检测1 896例标本中甲型流
感病毒阳性235份，筛查出甲型流感病毒H7N9亚型阳性标本127份。

H7N9报告结果与之江公司试剂检测结果的符合度达100%。

在H7N9病毒感染的早期阶段，WHO推荐用一种定量RT-PCR法检测。

随后一
些定量RT-PCR逐渐被应用于H7N9病毒检测，但这些方法仅被应用于分析
H7N9病毒中的H7和N9基因，没有同时检测M基因和RP基因。

M基因是新
型H7N9病毒的决定基因，RP基因控制测定结果的精确性。

此外，WHO推荐的引物与从新型H7N9病毒感染患者分离的公共基因序列间有轻微的差异。

因此，WHO实验步骤中M、H和N的引物位点没有完全匹配新型H7N9病毒的基因序列，检测引物和探针的核苷酸序列应该根据H7N9病毒序列的突变而进行修改。

在本研究中，我们使用了四重实时荧光定量RT-PCR方法同时检测Flu A和
H7N9病毒。

在四重反应中使用的H7和N9的引物和探针能够与新型高致病性
H7N9病毒和低致病性禽类H7N9病毒序列精确匹配，甲型流感病毒的引物和探
针能够以碱基简并的原则与大部分甲流病毒中含有的M基因匹配。

本文中使用的
简并碱基主要有R、S、M和Y，分别代表了A或G、G或C、A或C和C或T。

这些改变有助于利用PCR对这种病毒进行检测。

ABI Prism 7500荧光PCR仪可
以同时分辨4种不同的荧光信号，我们针对Flu A、H7、N9及内参RNase P的
探针分别用ROX、FAM、HEX和CY5荧光标记，可以实现单管同时检测并区分
上述病毒。

我们构建了各基因的标准片段，确定DNA的拷贝数作为标准品定量母液。

根据实验需要，将标准品定量母液稀释至所需最高浓度，并做10倍稀释至最低浓度，然后用该方法进行敏感性和重复性评价。

经实验研究表明，本方法对4种基因的最低检测限均达102 copies/mL，且重复性好，CV均≤1.56%。

并且在检测新型
H7N9病毒和RNA转录方面，该方法与其他病毒和致病原无交叉反应。

用本方法回顾性检测1 896例临床标本，其中235例Flu A和127例携带新型H7N9病毒的早期患者在实验中被发现。

四重荧光定量RT-PCR检测的阳性结果与上海之江公司生产的人感染H7N9禽流感病毒RNA检测试剂盒(荧光PCR法)检测结果一致。

这些结果表明，本研究设计的四重荧光定量RT-PCR方法能在1个反应管里灵敏并特异地检测Flu A、H7、N9及RNase P，较WHO推荐的方法，缩短了检测周期、显著简化了实验程序并降低实验费用。

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