与 AtGA20ox1启动子结合的转录因子筛选分析

与 AtGA20ox1启动子结合的转录因子筛选分析
钟曦;段秋红;李新梅;唐冬英;赵小英;刘选明
【摘要】Gibberellin (GA ) plays an important role in plant growth and development.Gibberellin 20-oxidase (GA20ox)is the key enzyme in the pathway of GA biosynthesis,so it is important to find the transcription factors that regulate the expression of GA20ox to reveal the mechanism underline GA metabolism and its regulation.In this study, AtGA20ox1 promoter was used to screen Arabidopsis transcription factor library by yeast one hybrid,and the transcription factor RAP2.4f was selected.Yeast one hybrid and X-gal assay results further confirmed that RAP2.4f can bind to the promoter of AtGA20ox1.CPRG quantitative analysis showed that their binding activity was very strong.Dual luciferase assay showed that RAP2.4f inhibited the AtGA20ox1 promoter activity.These results indicated that RAP2.4f might regu-late the transcription of AtGA20ox.%赤霉素（gibberellin，GA）在植物生长发育的各个时期发挥重要作用。

GA20-氧化酶（Gibberellin20-oxi-dase，GA20ox）是赤霉素生物合成途径中关键的限速酶，因此研究调控 GA20ox 基因表达的转录因子对进一步阐述赤霉素生物合成及其调控具有重要意义。

本研究通过酵母单杂交技术利用 AtGA20ox1启动子筛选拟南芥转录因子库，筛选获得转录因子 RAP2．4f；酵母单杂交和 X-gal 显色结果进一步证实 RAP2．4能与 AtGA20ox1启动子结合；CPRG 定量分析发现 RAP2．4f 与AtGA20ox1启动子结合作用强；双荧光素酶检测结果显示 RAP2．4f 对
AtGA20ox1的启动子活性具有抑制作用。

这些研究结果表明，RAP2．4f 可能参与调控 AtGA20ox1的转录。

【期刊名称】《激光生物学报》
【年(卷),期】2016(025)003
【总页数】7页(P263-269)
【关键词】赤霉素;AtGA20ox1;RAP2.4f;酵母单杂交
【作者】钟曦;段秋红;李新梅;唐冬英;赵小英;刘选明
【作者单位】湖南大学生物学院植物基因组学与发育调控湖南省重点实验室，湖南长沙 410082;湖南大学生物学院植物基因组学与发育调控湖南省重点实验室，湖
南长沙 410082;湖南大学生物学院植物基因组学与发育调控湖南省重点实验室，
湖南长沙410082;湖南大学生物学院植物基因组学与发育调控湖南省重点实验室，湖南长沙410082;湖南大学生物学院植物基因组学与发育调控湖南省重点实验室，湖南长沙410082;湖南大学生物学院植物基因组学与发育调控湖南省重点实验室，湖南长沙 410082
【正文语种】中文
【中图分类】Q943.2
赤霉素为四环双萜类化合物，是植物的主要激素之一，对植物生长发育有着非常重要的调控作用，如促进种子的萌发，子叶的扩展，茎的伸长，花的形成以及果实的成熟[1,2]。

在GA的生物合成途径中，按其在细胞内发生的部位不同可分为三个
阶段，第一个阶段在质体内完成，以牻牛儿牻牛儿焦磷酸 (gerany lgeranylpyrophosphate，GGPP)为前体，依次在古巴焦磷酸合酶(copalyl pyrophosphate synthase，CPS)和内根-贝壳杉烯合酶(ent-kaurenesynthase，KS)的催化下环化为内根-贝壳杉烯(ent-kaurene)[3]。

第二阶段在内膜上完成，转
运至内质网上的内根-贝壳杉烯经内根-贝壳杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase，KO)和内根-贝壳杉烯酸氧化酶(ent-kaurenoic acid oxidase，KAO)催化形成GA12，GA12也可在GA13-羟化酶(GA13-hydroxidase，GA13ox)作用下转化为GA53[4]。

第三个阶段在细胞质内完成，转移至细胞质内的GA12和GA53在GA20氧化酶的催化下分别形成GA9和GA20，最后在GA3氧化酶的催化下形成有生物活性的GA4和GA1[5]。

由此可知GA20-氧化酶是赤霉素生物合成途径中的关键限速酶。

GA20ox功能缺失突变体具有半矮生的表型，第一次绿色革命中水稻基因sd1呈矮杆的表型正是由于GA20ox基因突变所导致[6]；而GA20ox过表达植株则能导致赤霉素的合成增多而使植株明显加快生长[7]。

此外，GA20ox能受光周期调控，在拟南芥和菠菜(Spinacia oleracea)中，将植物从短日照条件转移至长日照条件，植物体内GA20ox的酶活性增加[8]。

在烟草中一个含有碱性亮氨酸拉链(bZIP) 转录因子RSG能与GA20ox1的启动子结合调控GA20ox1的表达来控制内源GA的含量[9]。

目前对GA20ox基因的研究主要集中在GA代谢途径中的作用，在拟南芥中关于调控GA生物合成的转录因子的研究还是很少。

RAP2.4f属于AP2/ERF转录因子基因家族，该家族非常庞大，含145个家族成员[10]，均含一个或两个保守的 AP2/ERF结构域[11,12]。

AP2/ERF结构域能与启动子中的乙烯反应元件(ERF/GCC-box 或是CRT元件/干旱反应元件(DRE)特异性结合[13,14]。

AP2/ERF类转录因子参与到植物生长、花的发育、分生组织和器官的形成以及对生物和非生物胁迫应答等各个事件中[15]。

本研究经过酵母单杂交实验、X-gal显色、CPRG分析以及双荧光素酶检测发现转录因子RAP2.4f与AtGA20ox1启动子结合，并且对AtGA20ox1的启动子具有抑制作用，表明RAP2.4f可能参与调控AtGA20ox1基因的转录。

烟草、E.coli DH5a 和农杆菌EHA105为本实验室保存；酵母菌株：YM4271与
EGY48，此酵母菌株为GAL4-LacZ报告基因系统；用于构建报道子的pLacZi载
体和拟南芥转录因子cDNA文库(cDNA 文库的AD 融合表达载体为pDEST22)为美国林辰涛实验室提供[16]。

以野生型拟南芥(Col-4)DNA为模板，利用软件Primer Premier 5设计引物，引
物序列如表1，应用高保真酶prime STAR ( TaKaRa)进行PCR扩增，其程序为：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min/1 kbp，共34个循环；72 ℃终延伸5 min。

基因目的片段扩增产物经回收纯化后，目的
片段产物与空载同时用限制性内切酶37 ℃酶切2 h，胶回收后用T4连接酶4 ℃
连接16 h，连接产物转化至感受态细胞E.coli DH5a中，涂布于含Kana抗生素
的LB平板上，挑选阳性单菌落PCR验证有目的条带后进行测序。

将AtGA20ox1启动子片段(2 710 bp)插入pLacZi质粒，构成目的质粒pLacZi- pGA20ox1。

参照酵母单杂交体系说明书的方法，将目的质粒经限制性内切酶
Apa I线性化后，采用醋酸锂转化法转入至YM4271酵母菌株，并整合于其酵母
菌株染色体上，接种于SD-Ura平板上，28 ℃培养2-3天。

挑选颜色大小正常的
菌落接种于SD-Ura液体培养基中28 ℃，200 r/min培养14-16 h，与活化好的EGY48酵母菌株(含拟南芥转录因子cDNA文库)进行融合，28 ℃，50 r/min融
合2天后，普通光学显微镜下观察酵母是否融合，将融合好的酵母点在SD-Ura-Trp平板上生长，待长出颜色大小均正常的克隆菌落后，将这些融合酵母进行LacZ报告基因的检测。

SD-Ura-Trp二缺平板上长出单菌落后挑取融合酵母菌落，加少量灭菌水混匀，吸取5 μL菌液转移至滤纸上。

将滤纸上的酵母菌落置于液氮速冻60 s，然后取出在室温下融解，如此反复冻融5-6次，使酵母细胞充分裂解。

将新鲜配制的Z Buffer/X-gal溶液(8 μL 100 mg/mL X-gal(上海生工)，5 μLβ-巯基乙醇，2 mL
Z Buffer)浸湿滤纸，置于30 ℃培养箱中避光培养1-8 h。

每半小时观察一次菌落
是否变蓝。

其中Z Buffer(500 mL)：氯化钾0.375 g，一水合磷酸二氢钠2.75 g，七水合硫酸镁0.123 g，七水合磷酸氢二钠8.05 g，溶于400 mL ddH2O中，调pH值至7.0，定容至500 mL，过滤除菌，室温保存。

在SD-Ura-Trp平板上挑取新鲜的生长正常的酵母菌落置于15 mL SD-Ura-Trp
液体培养基中，30 ℃，220-250 r/min摇床振荡培养14 h，准确记录OD600值。

12 100 r/min离心30 s，轻倒废弃上清，用1 mL Buffer l清洗菌液两次后，取300 μL (V2) Buffer 1加入EP管重悬菌液，轻甩菌液至EP管底。

取100 μL (V1)转移至已灭菌新EP管中。

液氮速冻60 s，取出置于37 ℃融解2 min，反复冻融
5-6次，以保证细胞充分裂解。

另向灭菌EP管中加入0.1 mL Buffer 1作为空白
对照。

实验组加入700 μL Buffer 2充分混匀后立即计时，此时间为起始时间(T1)。

30 ℃避光孵育1-24 h，当EP管中液体颜色由黄色变为红褐色时，迅速加入0.5 mL 3 mol/L氯化锌混匀终止反应，记录该时间，此为终止时间(T2)。

12 100
r/min离心1 min，采用空白对照在A240处校正，转移上清至新EP管中。

用紫
外-可见分光光度计测量上清液的OD578。

根据OD578值与换算公式，准确获取β-半乳糖苷酶的酶单位，通常以每个细胞1 min分解1 μmol CPRG的量作为1
个酶活力单位，具体换算公式：
β-galactosidase Units=1000×OD578/(T×V×OD600)，T=T2-T1(min)，
V=V3×V1/V2。

其中Buffer 1(50 mL)：氯化钠0.45 g，牛血清蛋白0.5 g，HEPES1.18 g，L-天
冬氨酸0.03 g，Tween20 25 μL，溶于37 mL ddH2O中，调pH值至7.3，定
容至50 mL，过滤除菌，4 ℃保存。

Buffer 2(20 mL)：27.1 mg CPRG(Sigma公司)溶于20 mL Buffer l中至终浓度2.23 mmol/L，过滤除菌，避光4 ℃保存。

通过电击转化方法将构建好的转录因子载体和启动子载体导入至农杆菌EHA105中，在含Kana抗生素和利福平的YEB平板上生长2天后，挑取单菌落于5 mL
含Kana抗生素和利福平的YEB液体培养基中，28 ℃，200 r/min培养14-16 h，以1∶500接种进行大摇，至对数生长期收集菌体，用infiltration buffer (200 mmol/L MES,100 mmol/L AS乙酰丁香酮,1 mol/L MgCl2,pH 5.6)调OD600至1.0，室温静止3 h，等体积混匀含转录因子和启动子培养液后，注射烟草，注射
完后烟草先暗培养24 h，再转移至正常光照条件下培养2天，然后按照双荧光素
酶检测试剂盒(Promega)操作说明书进行目的报告基因荧火虫荧光素酶(firefly luc，LUC) 及内对照海肾素荧光素酶( renilla luc，REN) 检测，计算LUC/REN的比值，并以空载体共转染细胞作对照。

为了得到与AtGA20ox1启动子结合的转录因子，采用酵母单杂交对拟南芥的转录因子库进行筛选。

首先，构建pLacZi-pGA20ox1载体，以野生型拟南芥幼苗总DNA为模板，用表1中的启动子上下游引物进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，检测到一条启动子全长约2 700 bp的单一清晰特异性扩增条带(图1)，将PCR产物克隆至含LacZ报告基因的pLacZi载体中，经限制性内切酶Apa I线性化后，转入至YM4271酵母菌株与含转录因子文库的EGY48酵母菌株融合后，点在SD-Ura-Trp平板上(图2a)。

pLacZi-pGA20ox1载体因带有一个LacZ报告基因，LacZ编码β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，能将β-半乳糖苷酶催化水解。

X-gal(l5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside)为D-半乳糖苷，是β-半乳糖苷酶的底物，能用X-gal检测报告基因LacZ表达。

将酵
母菌落转移至滤纸上，通过X-gal定性分析，避光孵育不同时间，筛选到6个显
蓝色的酵母菌落，其中的一个蓝色菌落为pLacZi-pGA20ox1与TFS6-F5融合酵
母(图2b)。

为了进一步验证AtGA20ox1启动子与筛选到的转录因子TFS6-F5结合的真实性，提取该酵母质粒，转化大肠杆菌，经测序证实为转录因子RAP2.4f。

随后，将pDEST22-RAP2.4f重新转化酵母EGY48菌株，与已转化pLacZi-pGA20ox1启
动子的酵母YM4271菌株相互融合，进行X-gal定性分析。

结果显示，融合了pLacZi/pDEST22组合酵母有微弱的自激活现象，另外两个阴性对照组合pLacZi /pDEST22-RAP2.4f、pLacZi-pGA20ox1/pDEST22均不显蓝色，pLacZi-
pGA20ox1/pDEST22-RAP2.4f显蓝色(图3a)，而且随着时间的增加，蓝色逐渐
加深(图3b)，说明转录因子RAP2.4f 能与AtGA20ox1启动子结合。

CPRG(chlorophenolred-β-D-galactopyranodide) 是氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷，也是β-半乳糖苷酶的底物，被β-半乳糖苷酶水解后生成红色产物。

CPRG的灵敏
度非常高，在波长578 nm处有最大吸收值，所以常用CPRG法做定量分析。

为
了检测AtGA20ox1启动子与RAP2.4f结合作用强度，采用CPRG方法对
AtGA20ox1启动子与RAP2.4f结合作用进行了定量分析。

根据培养液颜色的变化检测吸光度，计算β-半乳糖苷酶的活性。

结果如图4所示，pLacZi-
pGA20ox1/pDEST22-RAP2.4f组合的β-半乳糖苷酶的酶活力单位接近30，而pLacZi-pGA20ox1/pDEST22、pLacZi/pDEST22-RAP2.4f、pLacZi/pDEST22
的酶活力单位均在3左右，由此可知pLacZi-pGA20ox1/pDEST22- RAP2.4f组
合β-半乳糖苷酶的酶活力显著高于三个阴性对照，说明AtGA20ox1启动子与RAP2.4f结合作用强。

为了研究RAP2.4f与AtGA20ox1启动子在植物体内是否结合，我们采用双荧光
素酶报告系统检测了RAP2.4f对AtGA20ox1启动子活性的影响。

首先以质粒pDEST22/RAP2.4f为模板PCR扩增RAP2.4f基因，1%的琼脂糖凝
胶电泳检测显示获得与目的片段大小相符大小约为879 bp的单一清晰条带(图5a)。

pGreen II-0800-LUC-pGA20ox1载体以pLacZi-pGA20ox1为模板扩增
AtGA20ox1启动子，获得与目的片段大小相符大小约为2 760 bp的单一清晰条
带(图5c)。

目的基因克隆至相应载体后，获得阳性单克隆菌落，以RAP2.4f基因
特异性引物做菌落PCR进行初步鉴定，电泳检测结果显示PCR产物条带大小均约
为800 bp(图5b)。

以AtGA20ox1启动子基因特异性引物做菌落PCR进行初步
鉴定，电泳检测结果显示PCR产物条带大小均约为2 700 bp(图5d)。

分别选取
经鉴定为阳性的单菌落进行质粒抽提并测序，测序结果表明外源基因已插入相应载体，成功获得RAP2.4f-PEGD-MYC载体和pGreen II-0800-LUC-pGA20ox1载体。

以 PEGAD-MYC空载为对照组，RAP2.4f-PEGD-MYC重组质粒为实验组，通过
双荧光素酶检测分析发现，若将对照组对AtGA20ox1转录水平调控的影响作为1，实验组RAP2.4f对AtGA20ox1转录水平的影响降低，只有对照组转录水平的40%(图6)，由此可知，RAP2.4f抑制了AtGA20ox1的转录。

真核基因的表达受到多种因素调控，其中转录因子与启动子在转录水平上的表达调控有着非常重要的作用，因此，寻找调控基因表达的转录因子非常关键。

但是目前对调控拟南芥GA2ox基因家族的转录因子研究非常少。

Hiroshi Magome等人发现在拟南芥中AP2/ERF类转录因子DDF1在高盐胁迫下能作为一个转录激活因子上调GA2ox7的表达抑制GA的生物合成从而应答高盐胁迫[17]。

有文献报道RAP2.4f受干旱等逆境胁迫的诱导[18]，而且Rap2.4f可能通过非生物胁迫信号途径调控叶片的衰老[19]，其同源基因RAP2.4过表达时对光更加敏感，在蓝光、红光、远红光下胚轴比野生型短，且过表达植株更耐旱[20]。

在番茄中过表达
AP2/ERF类转录因子SlDREB能下调GA20ox1、GA20ox2和GA20ox4的表达[21]。

本研究通过酵母单杂、X-gal定性分析、CPRG定量分析、双荧光素酶报告基因检测，发现RAP2.4f与AtGA20ox1启动子结合，并且RAP2.4f抑制AtGA20ox1
启动子活性。

因此，推测AP2/ERF类转录因子RAP2.4f很有可能调控
AtGA20ox1的转录，我们将深入研究植物体内RAP2.4f对AtGA20ox1转录的调控作用。