人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)(1354-1802)的原核表达及抗血清制备

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)(1354-1802)的原核表达及
抗血清制备
王青泉;武建明;李秀梅;王立群;何洪彬;王洪梅;刘晓
【摘要】[ Objective]To prppare t-PA (1354-1802) antiserum and measure its titer, so as to lay a foundation for the deep studies on genernfunction of t-PA. [ Melhod] The 449 bp fragment of t-PA was obtained hy gene rloning techniques, and then recombined into pET-32a( + )rnvector. The recombinanl vector was confirmed by PCR and DNA sequence analysis. The positive recombinant plasmid was transformed intornBI2I (DE3) and then induced with IPTG for expression. [ Result ] An expected specific band of about 37 kD was determined by SDS-PAGE.rnThe fusion protein was purified and then used to immunize the New Zealand rabbits, and protein t-PA (1354-1802) anliserum was prepared.rnWestern blot analysis showed that the antiseum could bind to standard of t-PA protein. The E1.ISA titer of the rabbit i-t-PA (1354-1802) anli-rnsenirn was 1U28 00 approximately. [Conclusion]l-PA( 1354-1802)antiserum is successfully prepared, which lavs foundation for Ine in-depthrnsludy of t-PA gene.%[目的]制备人组织型纤溶酶原激活剂t-PA(1354-1802)抗血清,并测定其效价,为深入研究t-PA基因功能奠定基础.[方法]利用基因克隆技术获得t-PA(1354-1802)催化域基因片段,然后将其重组到pET-32a(+)质粒中,进行鉴定及序列分析;将测序正确的阳性质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导、蛋白纯化及免疫兔试验.[结果]SDS-PAGE结果显示,37 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备t-PA蛋白抗血清,Western blot分析表明,抗血清可与标准品t-PA蛋白特异性结合,
间接ELJSA方法检测抗血清的效价可达到1∶12 800.[结论]成功制备了t-
PA(1354-1802)抗血清,为t-PA基因功能的深入研究奠定了基础.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2012(040)016
【总页数】3页(P8905-8907)
【关键词】t-PA;原核表达;抗血清
【作者】王青泉;武建明;李秀梅;王立群;何洪彬;王洪梅;刘晓
【作者单位】东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;山东省农业科学院奶牛研究中心,山东济南250100;山东省农业科学院奶牛研究中心,山东济南250100;山东省农业科学院奶牛研究中心,山东济南250100;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;山东省农业科学院奶牛研究中心,山东济南250100;山东省农业科学院奶牛研究中心,山东济南250100;山东省农业科学院奶牛研究中心,山东济南250100
【正文语种】中文
【中图分类】S852.5
血栓性疾病是导致人类残疾和死亡的主要原因之一，我国每年患急性心肌梗死和脑血栓的患者达300多万人，该病严重影响患者的生存和生活质量［1－3］。

人组织型纤溶酶原激活剂(Tissue-type plasminogen activator，t-PA)是人体内生理性纤溶酶原激活剂(Plasminogen activator，PA)，主要由血管内皮细胞合成并分泌的一种单链糖蛋白［4］。

t-PA是一种高效特异的溶栓药物，对血栓中存在的纤
维蛋白－纤溶酶原复合物有较强的亲和力［5］，当t-PA接触血栓后，能迅速形成纤维蛋白-t-PA-纤溶酶原复合物，选择性激活血栓中的纤溶酶原生成纤溶酶，纤溶酶水解血栓中的纤维蛋白，但几乎不激活血液循环中的纤溶系统，从而高效特异溶解血栓而不引起全身出血现象，是一种理想的溶血栓药物［6］。

但当其进入血液后，半衰期仅为6～8 min［7］。

在临床治疗中必须大剂量静脉滴注才能维持其有效浓度，增加了全身出血的危险［8］。

笔者根据t-PA基因的自身特点，克隆、表达t-PA催化域上一段449 bp t-PA(1354-1802)基因片段，并制备其抗血清、测定其效价，Western blot检测该抗血清可否与标准品t-PA发生特异性结合，以期为深入研究t-PA的基因功能奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌种。

大肠杆菌感受态DH5α、BL21购自宝生物工程(大连)有限公司;pET-32a(+)表达质粒由山东省农业科学院奶牛中心分子生物学实验室保存。

1.1.2 试验动物。

2～3 kg新西兰白兔购自山东省农业科学院种兔试验基地。

1.1.3 工具酶和主要试剂。

标准品t-PA、限制性内切酶BamHI和 H indIII、Taq 酶、DL 2 000DNA Marker、蛋白分子量标准Marker以及T4 DNA Ligase均购自宝生物工程(大连)有限公司;质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒均购自Biomega公司;人肝脏cDNA购自clonetech;Ni-NTA纯化系统购自Invitrogen公司;弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、酶标小鼠His tag抗体及辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 和羊抗兔IgG均购自Sigma公司;TEMED、IPTG、PMSF、胃蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺等均为进口分装试剂。

1.1.4 引物。

根据GenBank中登录的t-PA cDNA序列(Accession Number
BC095403)，选取催化域上449 bp的片段进行原核表达。

利用设计软件Primer5.0和Oligo辅助设计引物。

同时，在引物中引入的酶切位点BamHI和
HindIII(下划线部
分):P1:5'CGCGGATCCGCGGAGGAGGAGCAGAAAT3';P2:5'CCCAAGCTTTGGG GATGATGCCCACCAAAGTC3'。

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法
1.2.1 t-PA基因片断的PCR扩增。

以从clonetech购买的人肝脏cDNA为模板，通过PCR扩增t-PA基因，设计引物，PCR扩增得到449 bp的片段，命名为t-PA(1354-1802)。

反应体系(总体积50.0 μl)为:Takara 5 ×PrimeSTAR TM
Buffer(含Mg2+)10.0 μl，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4.0 μl，目的基因上、下
游引物(25.0 μmol/L)、模板各1.0 μl;PrimeSTAR TM HS DNA Polymerase(2.5 U/μl)0.5 μl;灭菌ddH2O 32.5 μl。

反应条件为:95℃4 min;95℃变性30 s，58℃
退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环;72℃延伸3 min。

扩增结束后取PCR产物5 μl，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 重组表达质粒pET-32a-t-PA(1354-1802)的构建和鉴定。

胶回收试剂盒回
收PCR产物，与克隆载体pEASY-T3连接并转化，次日挑取白斑克隆，接入
Amp终浓度为100 μg/ml的5 ml LB液体培养基中，37℃，200 r/min过夜培养。

按质粒抽提试剂盒说明书提质粒后进行PCR及酶切鉴定，将菌液送往上海生
工生物技术有限公司测序，测序结果用DNAStar软件进行比对。

测序正确的pEASY-T3-t-PA(1354-1802)质粒和pET-32a(+)用BamHI和HindIII双酶切后回收目的片段，参照T4 DNA Ligase说明书按适当比例16℃连接12～16 h后转化感受态细胞DH5α，挑取单菌落进行PCR和双酶切鉴定。

将鉴定为阳性克隆的重
组质粒进行测序分析。

1.2.3 重组质粒的诱导表达、检测、纯化及Western blot分析。

将测序正确的阳
性质粒pET-32a-t-PA(1354-1802)及pET-32a(+)空载分别转化大肠杆菌BL21中，挑取单菌落37℃培养至OD值为0.4时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，30℃
诱导6 h后，收集诱导及未诱导的菌体进行SDSPAGE检测，采用Ni-NTA纯化试剂盒依照说明书提纯蛋白。

将纯化的蛋白5 μl进行12%SDS-PAGE电泳，60 V 恒压30 min后，100 V恒压2 h;150 mA恒流90 min转至PVDF膜上，将转膜后的PVDF膜用含5%的脱脂奶粉的TBST为封闭液过夜封闭;再用1∶4 000的酶标小鼠Anti-His的一抗和酶偶联的羊抗兔IgG稀释的二抗进行免疫标记;各取1 ml ECL化学发光试剂A、B液混匀，1 min后覆盖于PVDF膜的蛋白面，暗室反应2 min后去除残液，用ECL发光。

1.2.4 兔抗重组蛋白多克隆抗体的制备。

选取3月龄雄性新西兰大白兔3只，其中设对照1只，将纯化后t-PA(1354-1802)的蛋白1mg与等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，多点背部皮下注射新西兰白兔，进行第1次免疫;一免7 d后于双侧后肢腘淋巴结内各注射经弗氏不完全佐剂进行乳化后的抗原进行第2次免疫;二免7 d 后多点背部皮下注射经弗氏不完全佐剂进行乳化后的抗原进行第3次免疫;三免7 d后耳静脉采血测定效价，效价达到要求后心脏采血分离血清。

1.2.5 兔抗重组蛋白多克隆抗体检测及效价测定。

以1 μg/ml纯化的t-PA蛋白包被酶标板，pET-32a(+)空载蛋白为对照，将制备的多克隆抗体倍比稀释后作为一抗，同时以未免疫兔血清作对照，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗(1∶5 000)，DAB染色，采用间接ELISA方法测定多克隆抗体的效价。

1.2.6 抗血清为一抗的Western blot分析。

以兔血液分离得到的抗血清为一抗，标准品t-PA为抗原(蛋白分子量约为70 kD)，辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG为二抗。

稀释倍数为1∶4 000，按照Western blot操作标准步骤检测。

2 结果与分析
2.1 t-PA(1354-1802)基因的PCR扩增结果采用购买的人肝脏cDNA为模板扩增到目的基因，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得与预期结果一致的449 bp的目的条带，如图1所示。

图1 t-PA(1354-1802)基因的PCR扩增结果注:M.DL2 000 DNA Marker;1.目的片段。

2.2 pET-32a-t-PA(1354-1802)重组表达质粒的构建和鉴定结果用质粒提取试剂盒提取pET-32a-t-PA(1354-1802)重组表达质粒，经BamHI和HindIII双酶切鉴定，在约500 bp(t-PA基因)和5.9 kb(pET-32a)处各出现一条特异性条带，与预期目的条带大小基本一致(图2)。

图2 t-PA(1354-1802)基因的酶切鉴定结果注:M.DL10 000 DNA Marker;1.目的片段。

序列测定结果所克隆的t-PA(1354-1802)基因序列与GenBank上登陆的序列完全一致。

2.3 pET-32a-t-PA(1354-1802)重组表达质粒与 pET-32a(+)的诱导表达及纯化结果 SDS-PAGE分析诱导的表达产物，结果表明，与未诱导重组菌相比，诱导重组菌表达出与预测蛋白相一致的、分子量约为37 kD的特异性蛋白条带(图3)，采用Ni-NTA Purification System纯化的目的蛋白见图4。

2.4 t-PA(1354-1802)多克隆抗体的效价测定结果以间接ELISA方法，测定抗血清的效价，结果表明该试验所制备的兔抗血清效价大于1∶12 800。

图3 pET-32a-t-PA(1354-1802)重组质粒诱导结果注:1.诱导的pET-32a BL21空载表达蛋白;2.诱导pET32a-t-PA(1354-1802)BL21;3.未诱导的 pET32a-t-
PA(1354-1802)BL21;M.蛋白分子量标准。

图4 纯化后蛋白的SDS-PAGE分析注:1.纯化的pET-32a空载体蛋白，2.纯化pET-32a-t-PA(1354-1802)融合蛋白，M.蛋白分子量标准。

2.5 抗血清为一抗的Western blot分析结果从图5可以看出，Western blot分析结果显示目的条带检测结果明显。

图5 Western blot检测结果注:M.蛋白分子量标准;1.Western blot检测结果。

3 讨论
关于t-PA结构与功能已有了多方面的研究［9－10］，大量基础和临床研究证明，t-PA具有很强的抗血栓性能［11］，是目前防治以血栓形成为主要病理变化疾病的最有效药物之一［12］。

但由于其半衰期短(7 min左右)，限制了外源性t-PA
在临床上的广泛应用［13］。

众多科研工作者在改善t-PA溶栓效果上作了一系列的努力，构建了众多突变体［14－17］，也取得了一定的效果。

该试验在充分研究t-PA基因特点的基础上，选取t-PA催化域上的一段449 bp
片段，利用基因克隆技术将其重组到pET-32a(+)质粒中，转化BL21感受态细胞。

在进行IPTG诱导过程中，诱导温度和诱导时间的不同对其融合蛋白的表达有很大影响，通过多次条件摸索，最终确定诱导温度31℃，诱导时间为8 h，其蛋白表
达最高。

蛋白纯化过程中，宜直接采用冰上裂解菌体的方式，可使纯化的蛋白条带单一;而超声波破碎易带入菌体蛋白，不宜采用。

免疫兔的过程中，多次采血，ELISA测定抗血清效价，发现当免疫28 d后，其抗体峰值最高。

在得到抗血清的基础上，并用收集得到的抗血清做一抗，标准品t-PA做抗原，有目的条带出现，但同时也有其他蛋白杂带出现，分析可能是抗血清中含有其他杂蛋白，影响了其特异性结合效果。

总之，t-PA(1354-1802)抗血清的成功制备，为t-PA的深入研究提供了一个必要条件。

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