实验小鼠肠道内鼠隐藏管状线虫的分离与鉴定

健康养殖·诊疗
畜牧业环境 2020.17
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摘　要：实验小鼠在生命科学研究和生物技术研究中起着重要作用，其健康状况直接影响着实验结果的准确性。

鼠隐藏管状线虫（Syphacia obvelata）是啮齿类实验动物肠道内最常见的寄生虫，GB 14922.1-2001《实验动物 寄生虫学等级及监测》中要求鼠隐藏管状线虫阴性。

本研究中小鼠为某单位送检，取盲肠内容物显微镜检测，观察到明显虫体，随后进行虫体DNA提取和基因扩增并测序，序列分析结果显示为鼠隐藏管状线虫。

关键词：小鼠；鼠管状线虫；分离；鉴定1　前言
实验动物在生命科学研究和生物技术发展中起着重要作用，实验小鼠是实验动物的重要组成部分，其健康状况直接影响着实验结果的准确性。

蛲虫是人类（尤其是儿童）肠道内常见的寄生虫，同时也是实验小鼠中重要的寄生虫，严重干扰科学试验结果。

鼠隐藏管状线虫（Syphacia obvelata）又称鼠蛲虫，是寄生于啮齿类实验动物体内最常见的肠道寄生虫，对实验动物健康、抗体制备和实验结果影响巨大。

同时蠕虫（包括吸虫纲、绦虫纲、线虫纲和棘头虫纲）是中华人民共和国国家标准GB 14922.1-2001《实验动物 寄生虫学等级及监测》中必须检测的项目，要求阴性。

对虫体种类鉴定除了形态学鉴定外，随着PCR技术及现代分子生物学技术的发展，使用分子生物学技术对寄生虫进行种类鉴定和群体遗传研究也十分常见，目前国内外均有应用核糖体序列对实验鼠蛲虫进行分子鉴定的报道。

本研究中小鼠为某单位送检，该单位因实验小鼠被毛粗乱、生长缓慢而进行微生物及寄生虫检测。

经我实验室剖检，取小鼠盲肠内容物进行显微镜检测，观察到明显虫体，通过对虫体的初步形态学鉴定，怀疑为线虫，随后收集虫体进行DNA提取和基因扩增及序列分析，结果显示为鼠隐藏管状线虫。

2　材料和方法2.1　虫株来源
本研究所用的虫株分离于某单位送检的实验小鼠，在BSL-2实验室对小鼠实施安乐死后，在生物安全柜内剖开小鼠腹腔，剪开盲肠后肉眼可见6mm左右白色虫体，随后收集虫体用70%酒精固定，待下一步检测使用。

2.2　主要试剂
Taq聚合酶、Buffer、dNTPs为宝生物工程（大连）有限
公司产品，基因组提取试剂盒Wizard TM DNA Clean-Up System 购自南京赛泓瑞生物科技有限公司，DNA凝胶回收试剂盒购自北京全式金公司。

2.3　DNA提取
将虫体从70%酒精中取出，用双蒸水将虫体冲洗干净，加入蛋白酶K对虫体消化过夜，随后根据DNA提取试剂盒说明书对消化液进行纯化得到虫体全DNA，将纯化好的虫体DNA置-20℃冰箱保存备用。

2.4　引物合成
采用Bowles等人于1992年报道的用于扩增线虫cox1基因的引物JB3 5’-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3’和JB4.5 5’-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG- 3’对提取的虫体DNA进行PCR扩增，由宝生物工程（大连）有限公司合成。

2.5　PCR扩增
PCR扩增体系为25 mL，其中双蒸水16.2μL，10×PCR Buffer 2.5μL，2.5 mmol/L dNTPs 2μL，引物JB3（100 pmol/L）1 μL，引物JB4.5（100 pmol/L）1 μL，rTaq polymerase 0.3 μL，DNA模板2 μL。

扩增条件为94℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min，结束反应。

2.6　PCR产物回收及测序
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，目的片段大小约400 bp，按照DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒的说明进行操作，将单一条带的目的片段进行切胶回收。

回收产物委托上海生物工程技术有限公司用正向引物直接测序，测序结果使用DNAStar软件分析后在GenBank进行BLAST分析。

3　结果
3.1　PCR结果
引物JB3和JB4.5成功扩增出线虫cox1基因目的片段，与预期基因片段约400 bp长度相符，见图1。

M：marker；N：阴性对照；P：阳性对照；S：检测样品
图1 PCR扩增结果
实验小鼠肠道内鼠隐藏管状线虫的分离与鉴定
王利霞1，杨文祥1*，邵翠翠2，吴芳洁1，骆 伟1，邬源泉1
（1.湖北省疾病预防控制中心 应用毒理湖北省重点实验室，湖北武汉 430070；
2.湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北武汉 430075）
基金项目：湖北省生物医药产品研发检测共享平台项目（2018BEC478）
作者简介：王利霞，女，博士，兽医师。

研究方向：预防兽医学。

通讯作者：杨文祥，男，硕士，高级兽医师。

研究方向：基础兽医学。

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3.2　DNA测序及序列分析
测序结果经DNAStar软件分析后获得有效序列片段392 bp （图2），经BLAST分析，与GenBank公布的鼠隐藏管状线虫（Syphacia obvelata）cox1基因序列（GQ2260133.1）的相似度为100%，故鉴定为鼠隐藏管状线虫。

TATTAGTCATAGTATTTTATATTTAACTGGTAAGAAGGA GGTTTTTGGTCATTTGGGTATGGTTTATGCTGTTATTTCTATTG CTTTGATTGGTAGTGTTGTTTGAGGTCATCACATATTTACTGT TGGTTTTGATATGAGTACTCGTTTGTATTTTATAGCTGCTACT ATAATTATTGCTGTTCCTACTGGGATTAAGGTTTTTAGTTGGT TAATGACTTTGTTGGGTGGTTATTTTGTTGTTCATCCTTTATTA ATGTGGGTTATTGGTTTTATTTTTATGTTTACGTTGGGTGGTT TAACTGGTATTATGGTTGCTAATCCTGTTTTGGATAATTTGTT TCATGATACTTATTTTGTTGTTGCTCATTTTCATTATGTTCTTT CTTTAA
图2 PCR产物测序结果
4　讨论
线虫的形态学分类主要依据其虫体、虫卵大小、头部、尾管球、尾部特征以及外生殖器官的位置进行鉴定，但因寄生虫的种类繁多，存在同一种属虫体之间有个体差异，或者不同种属虫卵形态及大小接近等问题，单独依靠形态学鉴定很难做出判断进行分类。

分子生物学诊断技术的发展正好弥补了形态学鉴定的缺点，通过PCR扩增技术和基因序列测序技术，获得虫体的基因序列，从而实现从基因水平上对虫体进行种属鉴定及进化分析。

本试验中在送检实验小鼠中检测出鼠隐藏管状线虫，因该寄生虫具有发育周期短，病原传播不需要中间宿主等特点，一旦有小鼠感染，即会在整个群体中迅速传播，且很难彻底根除，一般建议直接淘汰全群小鼠，饲养间及所有笼器具全面消毒后重新引种扩繁。

鼠隐藏管状线虫作为GB 14922.1-2001的不得检出项，一旦发现即需要淘汰全群动物，建议在日常饲养管理中加强预防，避免感染。

饲养区要严防野鼠出没，饲料、垫料和饮水以及笼器具消毒彻底，进出饲养区的人员尤其是饲养员要做好个人防护及消毒工作，严防污染。

参考文献
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