凯氏定氮法消化实验方法的改进

凯氏定氮法消化实验方法的改进
在实验教学过程中，测粗蛋白质（CP）的传统方法是先消化粗蛋白质，在消化粗蛋白质时，耗费时间极长，容易引起烧干消化管，而使实验失败。

本人经过多年教学实践提出新的技术改进方法，这种新的实验方法大大缩短了消化时间，通过实验结果比较，本方法实验效果好，时间快，实验成功率高。

标签：实验教学；粗蛋白质；消化管
1 实验材料与试剂
1.1主要仪器
分析天平（0.0001g），KDN-20消化炉，半微量凯氏蒸馏装置。

1.2 试剂与材料
AR硫酸（密度为1.84g/ml），混合催化剂（CuSO4·5H2O，无水硫酸纳），过氧化氢（30%），氢氧化钠（40%），盐酸，四硼酸钠，硼酸（2%），甲基红，溴甲酚绿，95%乙醇，消化管，玻璃珠，小漏斗，50ml酸式滴定管，100ml容量瓶，20ml大肚移液管，250ml三角瓶。

样品为市售猪肉，火腿肠，蛋糕，面包，桃酥。

2 实验分组
将粗蛋白质消化实验方法分成四组：第一组，按凯氏定氮法的常规消化实验进行消化。

第二组，加样品与试剂同第一组，再加入AR过氧化氢（30%）5ml，立刻放入消化炉开始消化。

第三组，加样品与试剂同第一组，消化管上盖玻璃小漏斗放置过夜（14h）再放入消化炉开始消化。

第四组，加样品与试剂同第一组，消化管上盖玻璃小漏斗放置过夜（14h）再加入AR过氧化氢（30%）5ml，放入消化炉开始消化。

3 测定方法
3.1 传统方法
为国标方法GB5009.5-2003第一法，精密度为10%。

适用于各类食品蛋白质的测定：取样品0.5-1g（准确至0.0001g），放入消化管底部，加入混合催化剂2.5g放入消化管低部，浓硫酸20ml，玻璃珠三枚，上盖玻璃小漏斗，放入消化炉开始消化，将消化炉电压调至120v，过0.5h后再调至250v进行消化，消化好后按常规方法（凯氏定氮法）进行测定。

3.2 改进方法
取样品0.5-1g（准确至0.0001g），放入消化管底部，加入混合催化剂 2.5g 放入消化管低部，浓硫酸20ml，玻璃珠三枚，上盖玻璃小漏斗，放置过夜（14h），再加入过氧化氢5ml，放入消化炉开始消化，将消化炉电压调至120v，过0.5h 后再调至250v进行消化，消化好后按常规方法（凯氏定氮法）进行测定。

3.3 测定指标
测定样品蛋白质消化时间：用四种分组方法测定样品在蛋白质消化时所用的时间，测粗蛋白质含量：这四种分组方法在蛋白质消化好后，用同一种方法进行蛋白质蒸馏与滴定，计算粗蛋白质含量（系数6.25）。

每一种样品消化实验做两个平行样，每个消化平行样做两个平行蒸馏滴定实验。

3.4 测定方法
取5种样品分别用以上四种分组方法分组，测定蛋白质消化时间进行比较，见表1；消化好的样品通过传统的凯氏定氮法进行蒸馏与滴定，并做空白滴定对照，算出各样品粗蛋白质（%）含量，计算用下列公式：
CP=（V1-V2）×c×0.0140×F/m×100
CP：为样品中粗蛋白质的百分含量；
V1：为样品消耗盐酸标准溶液的体积（ml）；V2：为式剂空白消耗盐酸标准溶液的体积（ml）；C：为盐酸标准溶液的浓度（mol/L）；m：为样品的质量（g）；F：为氮换算成粗蛋白的系数为6.25；
各样品计算结果见表2。

4 数据处理
经DPS数据处理系统作单因素方差分析，用LSD法作多重比较。

5 结果与分析
表1 不同方法消化对消化时间的影响单位：小时（h）
由表1可知，不同试验组蛋白质消化所用的时间不同，第一组最长，第四组最短，第一组平均消化时间为6.08小时，第四组平均消化时间为3.44小时，第四组比第一组消化时间平均缩短2.64小时，差异极显著（p＜0.01）；第二组平均消化时间为4.94小时，第三组平均消化时间为4.7小时，第二组与第三组之间差异不显著（P>0.05），但与第一组比较，差异极显著（p＜0.01）。

表2 不同方法测定粗蛋白（CP）含量比较单位：%
由表2可知，不同试验组用同一种蒸馏与滴定的方法所测定出粗蛋白质的含量，各组之间差异不显著（P>0.05）。

6 讨论
6.1 綜上所述，传统凯氏定氮法测样品中蛋白质时，样品的消化时间很长，平均6.08小时，造成教学实验费时费力且操心，或容易造成消化管烧干或炸裂而使实验失败，本文改进的新方法大大缩短了蛋白质消化的时间，平均为 3.44小时，较传统凯氏定氮法消化时间平均缩短了2.64小时，省时省力，使教学实验按时完成。

两种方法所测得的粗蛋白质含量差异不显著（P>0.05）。

改进的新方法在教学实验中多次应用，效果较好，试验重复性较好。

6.2 实验新方法中，将实验样品加入浓硫酸和催化剂试剂后过夜再消化，有助于对样品的氧化与分解，在消化之前再加入少量过氧化氢（30%），有助于加快氧化反应。

过氧化氢具有强氧化性，在酸性条件下的还原产物为H2O，过氧化氢在常温可以发生分解反应生成氧气和水（缓慢分解），在加热或者加入催化剂（CuSO4·5H2O，Na2SO4）后能加快反应，2H2O2 被加热后生成2H2O+O2↑，因此加过氧化氢可加快消化过程。

7 结束语
综上所述，改进的消化实验新方法与传统方法相比，在操作步骤上有所改进，缩短了消化时间，又不影响蛋白质含量测定结果，操作简单易行，经过多个班级教学实验应用，效果较好，易于推广。

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作者简介：雷红（1966-），女，高级实验师，硕士，主要研究方向为饲料检测与分析。