凝胶等电聚焦法测定蛋白质等电点
等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点
等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点【实验原理】等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。
在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。
当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。
因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。
根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF．【试剂与器材】1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
2．1％(V/V)TEMED溶液。
3．5g/L过硫酸铵称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。
4．40％两性电解质载体。
5．0．5mmol/L磷酸溶液量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。
6．0．5mmol/L NaOH溶液称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。
7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。
8．酸性乙醇脱色液乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。
9．血清样本血清无须稀释，但最好透析去除离子。
10．电泳仪选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。
11．电泳槽圆盘电泳槽及电泳玻管。
12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。
食品安全检测农药兽药残留土壤成分分析焦炭成分分析【操作步骤】1．凝胶制备取洁净干燥的电泳玻璃管2支，将管底用胶布封闭，垂直放置在电泳管架上。
实验五 等电聚焦测蛋白质等电点
实验五等电点聚焦测蛋白质等电点Mangogola等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要进展，其实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
IEF的关键是得到一定范围内的稳定pH梯度，即找到合适的两性载体。
载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧基的同系物和异构物的混合物，其氨基和羧基的比例不同，使pH和pI相异、相近。
经过适当电泳时间后，两性电解质将依等电点递增的次序在支持物中从正极到负极彼此相互衔接，形成一平滑稳定的pH梯度。
蛋白质靠近正极在低于其pI的环境中带正电荷，向负极移动，反之则向相反方向移动，最终停在其pI处。
聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离等电点分子因pH的改变而重新带上正或负电荷，从而又向pI迁移。
最后测出蛋白质停留位置的pH即为该蛋白质的pH。
一．实验过程1.圆柱体凝胶制备用封口膜将玻管[D4×120mm]的一端封口，将玻管套上橡胶塞放置在支架上，加入凝胶至10cm处（注意摇动玻管，震出底部气泡），轻轻铺上一层双蒸水，放置聚合1h。
凝胶T=%，C=%，共4mL30%Acr，%Bis 1mL10%过硫酸铵双蒸水载体两性电解质样品液（BSA-10mg/mL）样品液（肌红蛋白-5mg/mL）TEMED共作三支管，每管加胶液约2.聚焦电泳在电泳下槽注入%硫酸500mL，将套有橡胶塞的玻璃管插入电泳上槽(注意塞紧所有孔，以防电极液下漏)，加入上槽溶液%乙醇胺约1000mL（注意排除凝胶下表面的气泡，凝胶上下表面都要接触电极液）。
接上电源，正极接酸，负极接碱，恒压160V至电流为0，再继续通电20min。
3.蛋白质染色及等电点测定用注射器向胶管注水取出胶条，测量胶体总长度及肌红蛋白距酸端（碱端）距离。
将其中一胶条放在玻璃板上用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入装有2mL10mM的KCl溶液中，浸泡过夜，次日用pH计测每支管中的pH值。
另外两只胶条在三氯乙酸中浸泡，等出现灰色条带时量总长及其距酸端（碱端）距离。
蛋白质等电点的测定
蛋白质等电点的测定蛋白质是生命体内构成最广泛的一类生物大分子，具有各种生物功能。
在生物体内，蛋白质具有正负电荷，并在不同PH值的溶液中表现出不同的电性质。
蛋白质在pH等于其等电点时，蛋白质的电荷处于中性状态，亦是纯蛋白质最稳定的情况，因此准确测定蛋白质等电点对于分离、纯化和鉴定蛋白质具有重要意义。
本文中将介绍三种测定蛋白质等电点的方法。
方法1. 等电点电泳法等电点电泳法是一种电泳分离方法，利用蛋白质在不同pH值下的电荷变化探测其等电点。
该方法的原理为将蛋白质经过电泳分离，直到电泳缓冲液pH等于蛋白质的等电点，此时蛋白质处于中性带中心。
与常规电泳仪不同的是，该仪器在酸性电极和碱性电极之间加入溶液，以确保酸碱缓冲系统能够维持所需的pH值。
等电点电泳法可以快速而准确地测定蛋白质等电点，但需要特殊仪器和耗时较长，且样品纯度较高。
方法2. 等电聚焦法等电聚焦法是一种电泳技术，利用在连续的pH梯度中，使具有等电点的蛋白质依次停止迁移，从而分离蛋白质。
该方法的原理是，利用蛋白质在不同pH值下的等电点特性，将样品置于pH梯度中，通过电压控制，使蛋白质在等电点处停止迁移，从而实现蛋白质分离。
等电聚焦法具有高分辨率和高分离效率，同时还可以同时分离出等电点相似但分子量不同的蛋白质，但样品量较小，需要特殊仪器和大量控制。
方法3. pH梯度管柱法pH梯度管柱法是一种可溶性蛋白质的标准测定方法，也是等电点法中最广泛应用的方法之一。
该方法的基本原理是，在含有不同pH值的缓冲液梯度的柱子上，蛋白质会在不同的pH值时呈现出不同的电荷状态。
在pH值等于其等电点时，蛋白质处于中性状态，停止迁移。
通过检测蛋白质在不同pH值下的吸收值，可以确定样品的等电点。
pH梯度管柱法的优点包括样品量较大，操作简单，数据可靠，但分辨率较低，需要特殊的柱子。
三种测定蛋白质等电点的方法各有侧重，实验操作难度大小也不同，一般来说，选择合适的测定方法应根据样品特点和实验条件。
等电聚焦凝胶电泳-依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离
等电聚焦凝胶电泳-依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离
等电聚焦凝胶电泳-依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离，蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以将蛋白质进行分离。
学术术语来源——
蛋白质组学相关技术在骨关节炎研究中的应用与进展
文章亮点：
1 此问题的已知信息：新兴的蛋白质组学相关技术已经成为研究包括骨关节炎的临床各类慢性疾病筛查和早期诊断蛋白质分子生物标记物的有效工具，同时也为骨关节炎发生和发展的具体机制研究提供了可靠的技术平台。
2 文章增加的新信息：骨关节炎关节软骨、滑膜和滑液组织与其同起源的正常组织的比较蛋白质组学研究为骨关节炎分子标志物的确定和靶向治疗药物的设计提供了最直接和最合理的研究途径。
生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件。
3 临床应用的意义：人类基因组计划的完成，科学家们开始着眼于下一步解释生物系统的正常和异常功能。
因此，在这些研究步骤中的一个焦点是关于蛋白质的功能。
随着后基因组时代的进入，已经发展出了新的工具来研究蛋白的表达、蛋白的相互作用以及确定骨关节病诊断和预后的新型生物标记物。
关键词：
组织构建；组织工程；综述；骨关节炎，蛋白质组，分子标志物；生物信息；国家自然科学基金
主题词：
骨关节炎；蛋白质组；质谱法
摘要
背景：蛋白质组学研究已经彻底改革了研究疾病的方式，提供了解开骨关节炎病理生理机制的途径。
目的：了解蛋白质组相关技术的研究成果及其在骨关节炎早期诊断、治疗效应。
血清蛋白等电点
血清蛋白等电点
血清蛋白的等电点是指在酸碱平衡下，蛋白质在溶液中呈电中性的pH值。
等电点是指蛋白质带有净电荷的平均电荷为零的pH值。
血清蛋白是血液中含有的各种蛋白质的总称，包括白蛋白、球蛋白、纤维蛋白等。
不同的血清蛋白具有不同的分子结构和氨基酸组成，因此它们的等电点也不同。
血清蛋白的等电点可以通过实验方法或计算方法来确定。
一种常见的实验方法是等电聚焦（isoelectric focusing），利用电场将蛋白质在凝胶中移动，直到它们达到零电荷状态。
这样，通过测量最终停止迁移时的pH值，可以确定血清蛋白的等电点。
另一种计算等电点的方法是基于蛋白质的氨基酸序列和对应的pKa值。
每种氨基酸都有特定的pKa值，表明该氨基酸在溶液中的酸碱性质。
通过计算氨基酸组成和对应pKa值，可以预测血清蛋白的等电点。
血清蛋白的等电点对于了解其电荷性质和在体内功能的理解具有重要意义。
在特定pH值下，蛋白质可能表现出特定的生理功能、相互作用和电泳行为。
因此，研究血清蛋白的等电点可以有助于深入了解其在健康和疾病状态下的变化和作用。
等电点聚焦测蛋白质等电点
实验四等电点聚焦测蛋白质等电点宫魁六组200928006841083一、实验原理：等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
二、实验仪器和用具：玻璃管（4支）、封口膜、试管架、细长滴管、注射器和长针头、培养皿、刀片、烧杯、微量移液器、圆盘电泳槽及电泳仪三、试剂：0.1M磷酸（500ml）、0.1M氢氧化钠（1000ml）、丙烯酰胺储液、两性载体电解质、TEMED、牛血清蛋白样品（0.5mg/ml）、过硫酸铵（10%）、三氯乙酸（10%）等四、实验步骤：1、先将玻管洗净，用封口膜封的一端垂直放在架上；2、配胶：丙烯酰胺储液0、67ml两性载体电解质0、2mlTEMED 0、004ml牛血清蛋白质样品0、04ml蒸馏水 2.9ml过硫酸铵0.02ml3、用细长滴管加入溶液至10cm高处，胶面上加3—3cm高水层，进行封闭，聚合10—50min，吸出上层水，用滤纸稍微吸取；4、在电泳槽上槽加800ml磷酸，下槽500ml氢氧化钠；5、将管接入电泳槽，要求上端浸入液面，下端不接触下槽底面，注意排除凝胶下表面的气泡；6、接上电源，正极接酸，负极接碱；恒定160v，4h左右，电泳至电流为“0”；7、取胶将聚胶后的含蛋白质样品的凝胶借助注射器针头注水取出；8、量取三条胶的长度；9、pH梯度的测定取KCl溶液分别加入2ml于10只小管中，将欲测pH 梯度的胶条置于玻片上，用刀片切成1cm长的小段，按顺序放入有标号的小管中，盖好盖子，室温下过夜；10、次日用pH计测每只小瓶中浸泡液的pH值。
蛋白质两性性质及等电点的测定
蛋白质两性性质及等电点的测定蛋白质是生物体中极其重要的有机化合物，是构成生物体的基本组成部分之一。
蛋白质具有很多种类和功能，不同的蛋白质在生物体内发挥着不同的作用。
蛋白质的性质也因其结构而异，其中包括两性性质和等电点。
本文将介绍蛋白质的两性性质及等电点的测定。
一、蛋白质的两性性质蛋白质是由多肽链组成的，其分子中含有氨基酸残基。
这些氨基酸残基中的羧基（-COOH）和氨基（-NH2）可以参与酸碱反应，所以蛋白质具有两性性质，能够在不同的pH值下呈现不同的电离状态。
1. 在低pH值下，蛋白质中的羧基处于质子化状态，成为正电荷，而氨基则不受质子化，保持中性。
因此，在低pH值时，蛋白质呈正电荷状态，称为阳离子。
2. 在高pH值下，蛋白质中的氨基受到氢离子的质子化，成为正电荷，而羧基则不受质子化，保持中性。
因此，在高pH值时，蛋白质呈负电荷状态，称为阴离子。
3. 在等电点附近，蛋白质的质子化和去质子化同时发生，羧基和氨基的质子化程度相等，呈中性状态。
此时，蛋白质没有净电荷，称为等电点。
由于蛋白质的两性性质，可以影响其溶解性、折叠构象和相互作用等特性，对其功能和生物学作用具有重要影响。
二、蛋白质等电点的测定等电点是蛋白质具有中性状态的pH值。
测定蛋白质的等电点可以帮助我们了解其溶解性、电动力学性质和酸碱加工过程中的变化。
常用的测定等电点的方法有以下几种：1. pH梯度电泳法：这是一种常用且广泛应用的测定等电点的方法。
在一个pH梯度上进行电泳，当蛋白质离子迁移速率和电场力相等时，达到等电点。
可以通过在梯度上观察蛋白质带的形成和移动情况来确定等电点。
2. 等电聚焦电泳法：这是一种利用电场作用下蛋白质在凝胶上垂直移动的方法，根据蛋白质在凝胶中的移动速率和电场力相等时的pH值来测定等电点。
3. 等电点电位计法：该方法利用等电点时蛋白质没有净电荷的特性，使用电位计测量蛋白质在不同pH值下的电位变化，找出没有净电荷时的pH值，即为等电点。
聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点
聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点一、目的：学习聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理及方法。
二、原理：等电点聚焦（isoelectric focusing, IEF）或简称电聚焦（electrof ocusing），也曾称等电点分离聚焦电泳等。
它是60年代中期出现的技术，克服了一般电泳易扩散的缺点。
近年来，等电点聚焦电泳又有了新的进展，可以分辨等电点只差0.001pH单位的生物分子。
由于它的分辨力高、重复性好、样品容量大、操作简便、迅速，在生物化学、分类学、分子生物学及临床医学研究等诸方面，都得到广泛应用。
等电点聚焦电泳产生pH 梯度的方法有两种：一是用两种不同的pH缓冲液相互扩散，在混合区形成pH梯度，此为人工pH梯度。
这种pH梯度不稳定，常用于制备电泳；另一种是利用载体两性电解质在电场作用下形成自然pH梯度。
本实验就是利用载体两性电解质形成的自然pH梯度进行蛋白质样品等电焦聚电泳的。
理想的载体两性电解质应该在其本身的等电点处有足够的缓冲能力和良好的导电性，且分子量要小，组成与被分析样品有所区别，对分析样品无变性作用或发生化学反应。
常用的载体两性电解质是一系列脂肪族多氨基和多羧基类的混合物，即是一系列的异构物和同系物，分子量在300—1000之间，各组分的等电点(pI)既有差异又相接近，pI的范围在2.5—11之间。
合成载体两性电解质的原料是丙烯酸和多乙烯多胺，合成反应如下：R1 和R2为氢或带有氨基的脂肪基。
这一反应的特点是生成众多的异构物和同系物的混合物，而不是均一的化合物。
混合物中各成分的含量、等电点的分布，取决于原材料的性质、比例和合成条件。
目前常用的载体两性电解质的商品有：Ampholine（LKB公司）、Pharmlyte（Phar macia公司）、 Serralyty（Serva公司），近来已有国产商品了。
不同厂家合成的方法不同，电泳的条件也略有不同。
实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点
实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点引言：蛋白质是生物体中一类重要的生物大分子，它们的功能和性质与其结构密切相关。
等电点是指蛋白质在溶液中存在时呈电荷中性的pH值。
当蛋白质的溶液中pH等于它的等电点时，蛋白质的正电荷和负电荷相等，从而净电荷为0。
等电点测定是一种常用的方法，用于确定蛋白质的等电点。
实验目的：1.掌握等电点聚焦技术的原理和操作方法。
2.利用等电点聚焦技术测定其中一种蛋白质的等电点。
材料与方法：1.实验仪器：等电点聚焦仪。
2.实验试剂：蛋白质样品、等电点聚焦凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、溶液缓冲液等。
3.样品制备：取适量的蛋白质样品，加入等电点样品溶液缓冲液，使其浓度适当。
4.等电点聚焦凝胶制备：根据实验需要，选择适当的pH梯度，制备等电点聚焦凝胶。
5.实验操作：将已制备好的等电点聚焦凝胶放置于等电点聚焦仪中，按照仪器操作说明进行调试和操作。
将样品加载到凝胶上，通过电场力使其在凝胶中聚焦移动，最终形成pH梯度。
根据蛋白质的等电点，蛋白质在凝胶中会聚焦在对应的位置。
6.凝胶分离与染色：等电点聚焦结束后，取出凝胶，根据需要进行分离和染色。
结果与讨论：等电点聚焦技术是一种高效、准确的测定蛋白质等电点的方法。
它利用电场力将蛋白质在凝胶中聚焦，根据蛋白质在不同pH条件下的电荷变化，最终确定其等电点。
该方法操作简便、结果可靠，适用于各类蛋白质的等电点测定。
结论：本实验利用等电点聚焦技术成功地测定了一种蛋白质的等电点，并通过凝胶分离和染色展示了等电点聚焦的结果。
等电点聚焦技术在蛋白质等电点测定中具有重要的应用价值，可以为蛋白质结构和功能的研究提供重要的参考。
[1]赵海洋.蛋白质等电点聚焦技术[J].广西科技大学学报，2024[2]张桂泉,王运青,刘晓东.蛋白质等电点聚焦的实验教学及质量考察[J].高等教育化学研究，2024。
等电聚焦电泳的两种方法
等电聚焦电泳（IEF）分离蛋白及测定蛋白质等电点等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”.二、仪器与试剂1．材料：蛋白样品2．试剂：聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、teiton-100电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000ml染色液：0.35g考马斯亮蓝R－150溶于300ml脱色液中，加热到60－70℃，加入0.3g硫酸铜。
脱色液：25％乙醇、8％冰乙酸溶于水样品缓冲液:1％Ampholine 、2％Triton X-100、9M尿素三、操作步骤：1, 样品制备：用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。
充分溶解后，离心去除不溶杂质。
2,制模具：洗干净两块IEF专用玻璃板，进行硅化和反硅化处理，两块玻璃板的硅化和反硅化面相对，放上夹条，夹子夹好。
3, 配胶：胶液组成：6ml胶母液（10％，19/1）6－8％尿素1ml Ampholine (pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED4, 灌胶：配好的胶迅速灌入模具5, 电泳：等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。
检测蛋白质等电点的方法
检测蛋白质等电点的方法
以下是 8 条关于检测蛋白质等电点的方法：
1. 电泳法呀，哇哦，就像让蛋白质们来一场赛跑！比如在凝胶上，不同的蛋白质会根据它们的电荷特性以不同速度前进，是不是很神奇呀？
2. 盐析法呢，就好像把蛋白质放在一个特殊的“筛子”里，随着盐浓度的变化，能看出它们的沉淀情况，这可是个很妙的方法哟！比如说鸡蛋清遇到盐会发生的变化。
3. 等电聚焦法，嘿，想象一下蛋白质顺着电势梯度找到自己的“专属位置”，多有意思呀！像在专门为它们打造的小天地里各就各位。
4. pH 滴定法，这就像是精确地调整酸碱度来引出蛋白质的神秘反应呀！比如慢慢地滴加酸碱看看会发生什么。
5. 分光光度法，哇塞，通过光的变化来洞察蛋白质的秘密，多酷啊！就像是用光线当钥匙打开蛋白质秘密的大门。
6. 超滤法呢，也好有趣呀，把蛋白质和其他东西分离开，就像在一个大混合物里精准地捞出我们想要的，你说好玩不？就拿混合溶液来试试呀。
7. 离子交换层析法，嘿，这就如同让蛋白质在离子的世界里穿梭筛选，找出它们的归宿，是不是很特别呢！就像在一个离子构建的迷宫里探索。
8. 透析法，哇哦，让蛋白质在膜的两边来回穿梭，想想就很刺激呀！就如同让它们玩一场特殊的“穿越游戏”。
我觉得每一种方法都有其独特之处和魅力呀，关键是能帮助我们更好地了解蛋白质的性质呢！。
实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点
等电点聚焦测蛋白质等电点一．实验目的1.了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。
二．实验原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
三．实验步骤1.凝胶制备按表1的比例配制4ml工作胶液，在真空干燥器中抽气10min。
每组4管，每管加胶液1.8ml。
混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部1cm处，在胶面上再覆盖3mm厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20～30min即可聚合。
表1 凝胶工作液配比2.电泳吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。
于电泳槽下槽加入0.2％的500ml 硫酸作正极；上槽加入0.5％的800ml 乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为300V ，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min 后，停止电泳，全程约需3h 。
3.剥胶电泳结束后，取下凝胶管，用水洗去胶管两端的电极液，按照柱状电泳剥胶的方法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾”，正极端呈酸性，负极端呈碱性。
剥离后，量出并记录凝胶的长度。
4.固定取其中的凝胶条3根置于一个小培养皿内，倒入10%放在三氯乙酸固定液中固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。
聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
小心地拔出玻管，并用蒸馏水洗去蔗糖溶液，把管固定 到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔 密封不漏）在上槽中加入5%磷酸缓冲液，在下槽中装入2%氢 氧化钠溶液。避免管下有气泡。上槽接电泳仪的正极，下槽 接负极，打开电源，先调电压至100 V，待电压稳定后再升 到300 V，电泳2 h以上至电流降为0，将电压调至0，关闭电 源。
5. pH梯度的制作
取另一条凝胶条放在玻板上，从凝胶的正极端开始，每 隔0.5 cm切下一段，依次放入已编好号并装有1 mL蒸馏水的 试管中，浸泡过夜。次日用酸度计分别测定每管浸提液的pH 值。以凝胶长度为横坐标，pH值为纵坐标，绘制标准pH梯度 曲线。
6 .蛋白质样品等电点的计算
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为： 固定后的蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离
(4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无 变性作用，其化学组成不同于蛋白质。
IEF-PAGE分离蛋白质并测定pI
(2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。
固定染色后凝胶条长度
（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
实验九 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 电泳测定蛋白质的等电点
一、目的要求 等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点方法
二、原理
聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing-PAGE，简称IEF-PAGE)：利用各种蛋白质 pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其 中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两 性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极 到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作 用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH 值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区 带。
测定蛋白质等电点：了解分析原理与实验方法的必备指南
测定蛋白质等电点：了解分析原理与实验方法的必备指南蛋白质是生物体内功能多样的重要分子，其性质与溶液中的pH值密切相关。
了解蛋白质的等电点对于理解其溶解性、稳定性和相互作用至关重要。
测定蛋白质的等电点可以帮助科学家们更好地理解蛋白质的特性，并在药物研发和生物工程等领域中发挥重要作用。
一、蛋白质等电点的原理。
蛋白质的电荷性质：蛋白质分子在不同pH值下带有正负电荷，这是由于其天然氨基酸残基上的带电基团。
等电点的定义：等电点是蛋白质溶液中净电荷为零的pH值，即带正电荷的氨基酸残基和带负电荷的氨基酸残基在该pH值下几乎相等。
二、测定蛋白质等电点的方法。
等电聚焦电泳（IEF）：利用电场将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中分离，根据其在电场中迁移的速率确定等电点。
等电点电泳（IPG）：使用具有梯度pH值的聚丙烯酰胺凝胶，将蛋白质根据等电点在凝胶中定位。
pH梯度电泳：通过在凝胶中创建pH值梯度，使蛋白质在凝胶中以等电点静止。
三、蛋白质等电点分析的应用和局限性。
蛋白质溶解性和稳定性研究：等电点可以指导蛋白质的溶解条件和稳定性的优化。
蛋白质相互作用研究：等电点的差异可以用于研究蛋白质与其他分子的相互作用。
方法局限性：测定蛋白质等电点需要考虑样品纯度、离子强度和其他实验条件的影响。
测定蛋白质的等电点是研究蛋白质溶解性、稳定性和相互作用的重要手段。
了解蛋白质等电点的原理和常用方法对于科学家们理解蛋白质特性具有重要意义。
然而，我们也要认识到测定蛋白质等电点的方法存在一定的局限性，需要综合考虑实验条件和样品特性。
随着技术的不断发展，蛋白质等电点分析将为药物研发和生物工程等领域的进展提供更多的指导。
图1。
等电聚焦电泳的原理和应用
等电聚焦电泳的原理和应用1. 原理等电聚焦电泳是一种基于蛋白质等电点（pI）差异的分析方法。
在等电聚焦电泳中，蛋白质被置于一个电荷梯度进行分离，直到达到其等电点时停止运动。
原理可分为以下几个步骤：1.1 准备电荷梯度电荷梯度是等电聚焦电泳中的关键。
通常使用聚丙烯酰胺凝胶，其中有两个极性的电解质进行稀释，创建一个pH梯度。
这个梯度会在凝胶中生成氢离子（H+）和氢氧根离子（OH-）。
1.2 样品加载样品通常会混合在一种称为“载体溶胶”的缓冲液中，以保持样品的pH稳定。
这些样品会在载体溶胶上浮，准备好进行电泳分离。
1.3 离子迁移一旦样品加载完成，电泳过程就开始了。
在电场的作用下，蛋白质在电荷梯度中迁移。
1.4 等电点停止当蛋白质在凝胶中达到其等电点时，它们的净电荷为零，停止迁移。
等电点是蛋白质的理论中性点。
2. 应用等电聚焦电泳在生物医学和生物化学研究中具有广泛的应用。
以下是一些应用示例：2.1 蛋白质分离和纯化等电聚焦电泳常用于蛋白质的分离和纯化。
通过优化电荷梯度和其他实验条件，可以实现对复杂样品的高分辨率分离。
这种方法对于深入了解蛋白质的结构和功能非常有帮助。
2.2 蛋白质组学研究等电聚焦电泳在蛋白质组学研究中发挥重要作用。
通过等电聚焦电泳，可以分析和比较不同样品中蛋白质的表达水平。
这对于研究疾病相关蛋白质的变化以及寻找生物标志物非常重要。
2.3 药物分析等电聚焦电泳在药物分析中也有应用。
它可以用来研究药物-蛋白质相互作用和药物的释放动力学。
这对于药物的开发和优化具有重要意义。
2.4 食品分析等电聚焦电泳在食品分析中也得到了广泛应用。
它可以用来检测食品中的蛋白质含量和质量，包括检测过敏原和添加剂。
这对于食品质量和安全性的监测非常重要。
3. 结论等电聚焦电泳是一种基于蛋白质等电点差异的分析方法。
它在分离和纯化蛋白质、蛋白质组学研究、药物分析和食品分析等领域都有广泛的应用。
这种方法具有高分辨率和灵敏度，对于研究生物分子在不同条件下的特性具有重要意义。
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一、原理:
IEF 1966年由瑞典科学家发明。
蛋白质分子由不同数量和比例的各种氨基酸组成，氨基酸侧 链在不同的pH值环境中所带的电荷不同，当蛋白质处于等电点时， 它的净电荷为零，因此可利用等电点差异分离。 凝胶等电聚焦法的关键是，它是一种多羧基多氨基的脂 肪族化合物，分子量在300-1000之间。国产和进口的两性电解质 载体均有各种规格。可以根据需要选择使用。良好的两性电解质 混合物，它的各种成分在等电点时有相当的缓冲能力。
二、具体实施方法
在凝胶中加入一种名为两性电解质载体(ampholyte ）的混合 物，在外加电场作用下，凝胶内就会形成一个从正极向负极依次 增加的pH梯度。在pH梯度环境中，加入含有不同等电点的蛋白质 混合样品进行电泳，无论它们的原始分布如何，（或在正极端； 或在负极端；或分布在整个凝胶中)，经过一定时间后，样品中各 组分都将分别聚焦在pH等于各自等电点的区域，形成分散的蛋白 质区带，使样品各组分得到分离。分别测定样品各组分聚焦部位 凝胶的pH值，就可以得到它们各自的等电点。由此可知，运用凝 胶等电聚焦法，不仅可以测定蛋白质的等电点，而且还可以将不 同等电点的蛋白质分离。
SDS-PAGE和IEF的异同
相同： 1、都是蛋白质电泳 2、都用聚丙烯酰胺做载体 不同： 1、分离原理不同，IEF按pI, SDS-PAGE按分子量 分离。 2、载体形状不同， IEF-柱状， SDS-PAGE-平板。 3、IEF中聚丙烯酰胺为抗对流介质，SDS-PAGE中 聚丙烯酰胺为分子筛。
蛋白质的分离模式图 箭头代表移动方向，箭头长短代表移动速度， 右图为平衡时蛋白质的分离状态。
三、实验方法及流程
电聚焦流程： 制备载体（加样）→电泳4h→剥胶 →固定（本次省略）→测定距离 ∟ →制作pH梯度→测定（电脑作图） 实验方法： 预先准备洁净玻璃管（0.5ⅹ9cm）两根，下端封闭垂直插在管架上。 按下列配方在小烧杯内配制凝胶溶液（5mL） 1、凝胶贮备液 2.5mL 2、两性电解质载体 0.25mL（老师处） 3、2%TEMED 0.25mL 4、蛋白质样品 （经计算有1mg左右） 5、蒸馏水(超纯水） （适量） 6、10%过硫酸铵 0.05mL（最后加） 轻轻混匀，立即用滴管装管至离上端0.5cm处，再缓慢加蒸馏水 3-5mm高，静止聚合30分钟。待凝胶与水之间有明显界面时，即聚合 完毕。