石榴根际土壤细菌的分子鉴定及其对石榴枯萎病菌的抑制作用

石榴根际土壤细菌的分子鉴定及其对石榴枯萎病菌的抑制作用摘要通过研究石榴病株的根际土壤细菌的生物学特性，分子鉴定，探索不同菌株对石榴枯萎病菌生长的影响，寻找有效的生防菌株，为石榴枯萎病的防治提供新的有效途径。

提取根际土壤中分离得到12种不同细菌菌株的DNA，利用其r DNA ITS 区段进行16S RNA PCR扩增进行分子鉴定；对云南省蒙自市新安所镇石榴枯萎病病枝进行分离纯化得到单一的石榴枯萎病菌，并观察其在12种土壤细菌菌液抹匀的PDA上的生长情况。

结果表明，编号为PSBS001,PSBS003,PSBS008,PSBS009,PSBS011的土壤细菌和枯草芽孢杆菌的同源性高达98%，初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus subtilis），并对石榴枯萎病菌有较好抑制作用。

关键词：石榴枯萎病；枯草芽孢杆菌；土壤细菌；分子鉴定；抑制。

石榴根际土壤细菌的分子鉴定及其对石榴枯萎病菌的抑制作用1 引言石榴,别称安石榴。

为石榴科木本植物。

石榴是云南省蒙自最著名的特色水果，栽培石榴历史已有七百余年，以前仅在房前屋后零星种植，1987年引入世界银行贷款后，蒙自县开始发展石榴。

通过政策引导、资金扶持、技术研发与指导、基础设施建设以及市场开拓，到2007年石榴种植面积发展到11.19万亩，投产面积7.29万亩，实现产量9.5万吨，产值2.65亿元。

2008年新植2500亩，全县面积发展到11.44万亩，投产面积8.3万亩，预计产量10.8万吨，产值3.2亿元。

石榴是蒙自一种重要的经济果树[1]，蒙自县新安所镇产的甜石榴果实具有色泽艳丽，粒大皮薄，肉厚核软，汁多味甜等特点,是我国石榴中难得的佳品。

蒙自石榴还具有萌芽开花一早、果实成熟早的优势。

蒙自甜石榴以其独特的品位在我国石榴市场上占有绝对优势地位，每年农历七月至九月是蒙自石榴鲜果成熟上市的最佳季节，产品远销国内28个省(市、区)及越南、俄罗斯等6个周边国家。

石榴还有广谱抗菌的作用,石榴皮中含有多种生物碱，其对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌等有明显的抑制作用，其中对志贺氏痢疾杆菌作用最强，石榴皮水浸剂在试管内对各种皮肤真菌也有不同程度的抑制作用，具有很高的经济价值[2]。

随着石榴种植规模的逐渐扩大，石榴病害日益严重。

石榴上常见的病害有石榴果腐病[3]，石榴干腐病[4]，石榴褐斑病[5]等。

近年来，由甘薯长喙壳引起的石榴枯萎病相继在印度、中国出现，并在短期内造成石榴植株大片枯死，严重影响了石榴的生产和发展，造成了巨大的经济损失。

根据甘薯长喙壳菌目前国内外的研究概况，从石榴生产的实际出发，采集云南省蒙自市新安所镇的发病石榴的枯萎病标样，进行分离培养，鉴定；并对石榴枯萎病根际土壤细菌进行分离、纯化，得到不同的细菌菌株，提取DNA，采用16s RNA 通用引进行PCR扩增,再进行测序，到NCBI网站进行比对，最后确定为何种细菌；本研究旨在探索石榴根际土壤细菌的分离和形态分子鉴定及其病原菌在不同菌株菌液环境和不同菌株菌液的不同浓度下的生长特性，寻找有效的生防菌株，为该病菌的防治提供新的有效途径。

目前，随着石榴种植规模的不断扩大，石榴枯萎病影响了石榴的生产，造成石榴生产的经济损失。

甘薯长喙壳Ceratocystis fimbriata Ellis. et Halsted引起的石榴枯萎病1990年首次在印度的Bijipur地区发生，至1993年已蔓延整个Karnataka地区。

石榴园中病株年平均死亡率达7.5% 。

2001年在云南省蒙自县相继发生石榴枯萎病[6]，经作者刘云龙分离鉴定以及致病性测定，证明病害是由甘薯长喙壳引起的，为国内果树新病害。

有关研究报道，茶枝小蠹虫Xyleborus fornicatus可能是石榴枯萎病的传播媒介之一。

对于石榴枯萎病的防治，2002年黄琼[7]、刘云龙等相继报道了云南石榴枯萎病，2005年毛忠顺等报道了化学杀菌对石榴枯萎病菌的抑制作用，此后，邓吉[8]等报道了氟硅唑等化学农药对石榴枯萎病菌有较好作用。

但是，截止目前未见对石榴枯萎病菌有较好抑制作用的生防菌株的报道。

在国外，石榴枯萎病仅在印度有报道。

1993年，印度开始发现石榴枯萎病，1999年Y. M. Somasekhara.报道了石榴枯萎病[9]；2000年，发现石榴枯萎病蔓延的比较快，同年他报道该病可能会影响到石榴种植业的发展；2002年研究发现枯草芽孢杆菌对石榴枯萎病菌有抵制效果，但未在田间大规模应用；2006年，筛选出了对石榴枯萎病有较高抗性的石榴品种，同年，报道了在马哈拉施特拉邦、卡纳塔卡、安得拉三个邦都有石榴枯萎病发现，发病率从0.74－8.14%不等；其间相继报道了石榴园常用除草剂对石榴枯萎病菌的影响[10][11]，草甘膦、乙氧氟草醚和百草对石榴枯萎病菌有较强的抑制作用。

2011年，汤东生[12-16]等报道了杂草协调枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis对石榴枯萎病菌有一定抑制作用。

但其生防菌株也不是来自当地，因而从当地病土中分离得到的不同细菌菌株，利用菌液提取DNA，再把产物进行PCR，进行分子鉴定；以云南省蒙自市新安所镇石榴枯萎病病枝进行分离纯化得到单一的石榴枯萎病菌，观察石榴枯萎病菌在不同菌株的菌液抹匀的PDA上的生长情况，以期得更好的结果。

2 材料与方法2.1 试验时间、地点2.2 试验材料与仪器2.2.1 标本采集2011年3月在云南省蒙自市新安所镇的发病石榴园调查发病植株症状、采集发病的石榴的枯萎病枝、病茎及健康植株组织标样、石榴病株的根际土壤。

使用发病石榴的病茎、病枝病健交界植株组织进行分离、培养得到石榴枯萎病病菌样本。

将采集的发病石榴的根际土壤，进行细菌分离、纯化，得到不同的细菌菌株。

2.2.2 材料与药品试剂土豆，葡萄糖，BIOWEST AGAROSE，次氯酸钠，氢氧化钠，浓盐酸，去离子水，石蜡油，蛋白酶K(20mg/ml)，土壤基因组DNA快速提取离心柱形（北京百泰克生物技术有限公司），细菌基因组DNA提取试剂盒离心柱形（北京百泰克生物技术有限公司），真菌提取试剂盒柱式（Andy Bio），16S RNA PCR扩增试剂。

2.2.3 实验仪器恒温培养箱，摇床，冰箱，培养皿，接种针，7.0mm的打孔器，滤纸，直尺，玻棒，培养皿，三角烧瓶，试管，酒精灯，5cm3指形管，高压灭菌锅，记号笔，酸度显示器，电子显微镜，载玻片，盖玻片，血球计数板，移液枪，DYY-6C型电泳仪，数显恒温水浴锅，日立台式冷冻离心机，AB＆9902PCR仪。

2.3 试验方法2.3.1 石榴枯萎病菌的分离用清水将病健交界植株组织冲洗干净，用灭菌手术刀取病变维管束组织3×4mm大小，经75%酒精溶液消毒,再用次氯酸钠溶液消毒, 用灭菌水漂洗三次, 用灭过菌的过滤纸吸干水后移到PDA培养基,置于25 ℃的恒温培养箱培养。

从菌落边缘挑取菌丝移植于PDA培养基平板上，再从移植的菌落边缘挑取菌丝，移入另一PDA平板上，重复上述操作直到获得纯菌落[17]。

将纯化的病菌移到PDA平板培养基上，置于25℃恒温培养箱培养。

并对其进行形态及子鉴定。

将在PDA平板上纯化培养的菌丝体移入PDA斜面，25℃恒温培养箱培养10d，备用。

2.3.2 土壤细菌的分离称10克石榴根际土壤于无菌250ml锥形瓶中，用已灭菌的量筒量取无菌水定容至100mL，振摇约20分钟，使土样与水充分混匀。

无菌操作台上，在酒精灯火焰附近用无菌移液枪从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中，均匀混合，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。

然后用无菌移液枪分别由10-4、10-5、10-6三管土壤稀释液中各吸取0.1ml对号放入已经编号的稀释平板中，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，室温静置10分钟，使菌液吸附进培养基。

25℃恒温培养箱培养3天[18]。

观察菌落特征，从稀释度合适的培养平板上挑取每一菌落各在不同的平板上划线分离，并进行编号，再进行纯化，得到不同的细菌菌株。

2.3.3 土壤细菌的DNA提取取500ul菌液离心(10000rpm，1分钟)，弃上清；加入200ulRB溶液再离心(10000rpm，30秒)，弃上清；重悬于200ulRB，加入200ulCB溶液，剧烈充分混匀；加入40ul蛋白酶K(20mg/ml),70℃水浴10分钟；冷却后加100ul异丙醇剧烈混匀，溶液和絮状沉淀加入吸附柱AC中，离心(10000rpm,30秒)弃废液；加入500ulIR溶液离心（12000rpm，30秒）弃废液，加入700ulWB溶液离心(12000rpm,30秒)弃废液，加入500ulWB溶液离心(12000rpm,30秒)弃废液；将吸附柱AC放回收集管中，离心(13000rpm,2分钟)，把AC 放入一个干净离心管，在AC附膜的中间部位加入100ulEB（事先在65-70℃水浴中预热），室温放置3-5分钟，离心(12000rpm,1分钟)；将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，离心(12000rpm,1分钟)；检测DNA的浓度，取少量样品跑电泳[19]。

产物的琼脂糖凝胶检测，称取2g琼脂糖于100ml0.5×TBE中，加热溶解，冷却至65℃左右再加入终浓度为0.5%-1.0%的EB；电泳胶模两端用透明胶带封固，梳子至于适当位置，将冷却至65℃左右的琼脂糖溶液慢慢倒在胶模上，厚度约3mm。

静置，待胶凝固后揭去胶模两端的透明胶带，放入电泳槽内，倒入适量电泳缓冲液小心拔出梳子。

将3ul提取的细菌DNA样品，与等体积溴酚蓝指示剂混匀，加入凝胶点样孔内，防止产生气泡和样品溢出[20]。

将电泳槽通电，80V恒压电泳90分钟。

电泳完毕，关掉电泳仪，小心取出凝胶置于紫外灯下观察结果，DNA条带橙绿色荧光。

2.3.4 土壤细菌的16S RNA PCR扩增引物设计[21]，引物由生工生物工程有限公司合成扩增体系为25ul体系[22]，扩增程式产物的琼脂糖凝胶电泳检测。

2.3.5 扩增产物的测序与分析扩增产物交由华大基因公司测序。

将测序结果进行NCBI比对，采用DNAman V6遗传距离分析，初步鉴定编号PSBS001，PSBS003，PSBS008，PSBS009，PSBS011菌为芽孢杆菌属。

2.3.6 土壤细菌对石榴枯病菌的抑制作用根据菌落形态及其分子生物序列鉴定的结果，初步鉴定了编号PSBS001，PSBS003，PSBS008，PSBS009，PSBS011菌为枯草芽孢杆菌。

并进行抑菌试验。

用PDA培养基（土豆200g，琼脂20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml），用土壤细菌进行血球计数板计数制得200vl分别带有103、104、105个细菌的菌液，并用移液枪吸取到平板上抹匀，用直径为7.0mm的打孔器取石榴枯萎病病菌菌饼接种到PDA平板培养基上正中，每个处理10皿，对照10皿，每个培养皿培养基基本一致，每1000ml倒50皿，置于25℃恒温培养，每24h观察并去除被污染菌落的培养皿，直到第10天观察菌落形态并测定菌落两个相互垂直直径。