中药与庆大霉素联合对16SrRNA甲基化酶耐药重组菌的作用研究

櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄 沼，２０１６，４７（１）：２１３－２２０．［１９］谌　微，张凤英，王　景，等．基于ＣＯＩ基因序列的东、黄海区野生与养殖大黄鱼遗传多样性分析［Ｊ］．中国水产科学，２０１６，２３（６）：１２５５－１２６７．［２０］陈雪峰，杨国梁，孔　杰，等．人工养殖与选育对罗氏沼虾遗传多样性的影响［Ｊ］．水生生物学报，２０１２，３６（５）：８６６－８７３．［２１］郑荷子，易提林，梁旭方，等．翘嘴鳜连续４代选育群体遗传多样性及遗传结构分析［Ｊ］．淡水渔业，２０１３，４３（６）：８－１２．［２２］ＬｏｕｇｈｎａｎＳＲ，ＤｏｍｉｎｇｏｓＪＡ，Ｓｍｉｔｈ－ＫｅｕｎｅＣ，ｅｔａｌ．Ｂｒｏｏｄｓｔｏｃｋｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｆｔｅｒｍａｓｓｓｐａｗｎｉｎｇａｎｄｓｉｚｅｇｒａｄｉｎｇｉｎｂａｒｒａｍｕｎｄｉ（Ｌａｔｅｓｃａｌｃａｒｉｆｅｒ，Ｂｌｏｃｈ）［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２０１３，４０４：１３９－１４９．［２３］Ｖｅｌａ－ＡｖｉｔｕａＳ，ＭｏｎｔａｌｄｏＨＨ，Ｍａｒｑｕｅｚ－ＶａｌｄｅｌａｍａｒＬ，ｅｔａｌ．ＤｅｃｌｉｎｅｏｆｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙｉｎａｃａｐｔｉｖｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＰａｃｉｆｉｃｗｈｉｔｅｓｈｒｉｍｐＰｅｎａｅｕｓ（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ）ｖａｎｎａｍｅｉｕｓｉｎｇｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅａｎｄｐｅｄｉｇｒｅｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１６（４）：１１．［２４］ＷｒｉｇｈｔＳ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｓｏｆｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｍ］．Ｃｈｉｃａｇｏ：ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｃａｇｏＰｒｅｓｓ，１９７８：５８０．［２５］马　波，姜作发，霍堂斌．下游黑龙江茴鱼种群遗传变异及地理分化的微卫星分析［Ｊ］．中国水产科学，２００９，１６（５）：６７８－６８８．［２６］傅建军，李家乐，沈玉帮，等．草鱼野生群体遗传变异的微卫星分析［Ｊ］．遗传，２０１３，３５（２）：１９２－２０１．陈　琳，管远红，黄东璋，等．中药与庆大霉素联合对１６ＳｒＲＮＡ甲基化酶耐药重组菌的作用研究［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（２０）：２００－２０３．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．２０．０５１中药与庆大霉素联合对１６ＳｒＲＮＡ甲基化酶耐药重组菌的作用研究陈　琳，管远红，黄东璋，齐富刚，张洪涛，陈冬冬，区卓麟，于淼淼，吴怀秀，杨雨秋，陈瀛川，王亚南，苏哲君，张　欢（江苏农牧科技职业学院动物医学院，江苏泰州２２５３００） 摘要：为分析中药与庆大霉素联合对１６ＳｒＲＮＡ甲基化酶ＲｍＢ耐药重组菌的作用，采用棋盘稀释法测定庆大霉素与黄连、五倍子、连翘、黄芩、乌梅的联合抑菌指数（ｆｒｉｃｔｉｏｎａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ，ＦＩＣＩ）。

试验结果表明，黄连、五倍子、连翘、黄芩、乌梅与庆大霉素的联合抑菌指数（ＦＩＣＩ）分别为０．７５、０．２５、１．５０、２．００、０．７５。

提示中药五倍子与庆大霉素联合有协同作用，黄连、乌梅与庆大霉素联合有相加作用，连翘、黄芩与庆大霉素联合呈现无关作用。

关键词：１６ＳｒＲＮＡ甲基化酶；庆大霉素；中药；抗耐药；棋盘稀释法；联合药敏试验 中图分类号：Ｓ８５９．７ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１８）２０－０２００－０４收稿日期：２０１７－０５－０２基金项目：中国博士后科学基金面上项目（编号：２０１３Ｍ５４１７４０）；江苏省泰州市科技支撑项目（编号：ＴＮ２０１５１９）；江苏农牧科技职业学院重点项目（编号：ＮＳＦ２０１５０３、ＮＳＦ２０１６０３）；江苏农牧科技职业学院大学生创新创业训练计划（编号：２０１６１２８０６０３７Ｙ）。

作者简介：陈　琳（１９７０—），女，四川大竹人，博士，副教授，主要从事抗菌药物耐药机制及兽药安全性评价工作。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｌｉｎ２００８６６６＠１２６．ｃｏｍ。

当前，耐药性是临床抗感染治疗面临的严重挑战，抗耐药菌感染已成为全球性临床医学重大难题［１－５］。

研究表明，中药对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐药鲍曼不动杆菌、产超广谱β－内酰胺酶耐药菌均有一定的影响和作用［６－１０］。

虽然从抗菌效价或抗菌作用强度比较，几乎所有中药的抗菌作用均弱于抗生素［１１］，但是由于中药不但可以作用于细菌繁殖的不同阶段及多个代谢环节，中药和西药联用还可以相得益彰，为临床用药提供更多的选择［１２］，同时，中药能够从整体上提高机体的免疫功能，减轻感染引起的病理损害，起到非特异性治疗的作用［５］。

如熊南燕等报道，体内外无抗菌活性的鱼腥草注射液，对兔体内硫酸庆大霉素注射液抗菌活性有明显增强作用［１３］。

笔者所在课题组前期研究中发现，中药黄连、黄芩、五倍子、连翘等对１６ＳｒＲＮＡ甲基化酶ＲｍｔＢ耐药重组菌有一定的抑制作用，而氨基糖苷类抗生素是治疗革兰氏阴性菌感染的重要药物，由于１６ＳｒＲＮＡ甲基化酶的出现，导致庆大霉素、阿米卡星等氨基糖苷类抗生素在临床抗革兰氏阴性感染中丧失其作用。

因此，本研究拟以构建的１６ＳｒＲＮＡ甲基化酶ＲｍｔＢ耐药重组菌为研究对象，研究黄连、五倍子、黄芩等几种中药免煎颗粒联合庆大霉素对１６ＳｒＲＮＡ甲基化酶ＲｍｔＢ耐药重组菌的作用，一方面为临床用药提供依据，另一方面，为１６ＳｒＲＮＡ甲基化酶耐药菌感染提供更多的治疗用药选择。

１　材料与方法１．１　菌株１６ＳｒＲＮＡ甲基化酶ＲｍｔＢ耐药重组菌ｐＲｍｔＢ１。

质控菌Ｅ．ｃｏｌｉＡＴＣＣ２５９２２，购自卫生部药品生物制品检定所。

１．２　培养基水解酪蛋白肉汤（ＭＨＢｒｏｔｈ），水解酪蛋白琼脂（ＭＨａｇａｒ），购自杭州天和微生物试剂有限公司。

红四氮唑，购自扬州科能生物技术有限公司。

１．３　供试药物黄连颗粒（批号１５０１１４０，生药含量３ｇ）、醋五味子颗粒（批号１５０２０９９，生药含量６ｇ）、连翘颗粒（批号１４１１０５２，生药含量１０ｇ）、乌梅颗粒（批号１４１２０６２，生药含量１０ｇ）、黄芩炭颗粒（批号１３０３１４３，生药含量１０ｇ）、五倍子颗粒（批号１４０８１２５，上药含量３ｇ），均购自江阴某药业有限公司。

硫酸庆大霉素（批号０３０４，含量５９０μｇ／ｍｇ）。

１．４　受试药液的制备及稀释称取受试中药颗粒，分别用灭菌超纯水溶解成如表１所示的药物浓度，针头滤器过滤后分装，于－２０℃或－７０℃冷冻保存备用。

表１　药物贮备液配制浓度药物溶剂贮备液浓度（ｍｇ／ｍＬ）黄连颗粒水２５６０连翘颗粒水２５６０乌梅颗粒水２５６０黄芩炭颗粒水２５６０五倍子颗粒水２５６０硫酸庆大霉素水２５６０１．５　菌液制备在ＭＨ琼脂平板上挑取ｐＲｍｔＢ１单个菌落接种于２～５ｍＬＭｕｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨ）肉汤管中，３７℃振荡培养４～８ｈ，用调节过钙镁离子的ＭＨ肉汤稀释菌液，使稀释菌液达到０．５麦氏比浊管浊度，再按１∶１００稀释菌液至含菌量约为１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ，备用。

１．６　联合用药测定方法采用棋盘微量稀释法（ＣｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄＭｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ）［１４－１６］测定２种药的部分抑菌浓度指数（ｆｒｉｃｔｉｏｎａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ，ＦＩＣＩ）。

具体操作如下：首先，应用微量稀释法测定２种药物的ＭＩＣ，作为棋盘稀释法的中心浓度。

然后分别以２种药ＭＩＣ的２、４、８、１６倍及１／２、１／４、１／８倍稀释药物。

取出无菌的９６孔微量细胞培养板，置于超净工作台，向９６孔微量细胞培养板的前８行及前８列各孔中加入肉汤稀释好的菌液（１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ）１００μＬ。

然后分别沿纵轴加入不同浓度的甲药５０μＬ，沿横轴加入不同浓度的Ｂ药５０μＬ，Ａ药单沿横轴１～７孔分别加入２倍稀释的Ａ药１００μＬ，Ｂ药单沿纵轴１～７孔分别加入２倍稀释的Ｂ药１００μＬ，第９列肉汤组只加入肉汤２００μＬ，第１０列菌液组只加入菌液２００μＬ。

加样完毕后，将细胞培养板置于３７℃培养１６～１８ｈ。

观察结果前２ｈ，于细胞培养板的每孔均加入０．５％的红四氮唑溶液５μＬ，３７℃继续培养２ｈ，分别观察记录２种药单独作用的最低抑菌浓度（ＭＩＣＡ及ＭＩＣＢ）及联合作用的最低抑菌浓度（ＭＩＣＡＢ及ＭＩＣＢＡ）。

当第１０列菌液对照组的细菌明显生长，呈现红色，第９列肉汤对照组无细菌生长，呈现无色，各试验组小孔内能完全抑制细菌生长的最低药物浓度即为ＭＩＣ值（即第１个颜色不变的小孔所对应药物浓度即为ＭＩＣ）。

如出现单一跳孔，则记录抑制细菌生长的最高药物浓度，如出现多孔跳孔的现象，则必须重新试验。

１．７　联合用药判定标准按照下列公式计算部分抑菌浓度指数（ＦＩＣＩ），按照表２的判定标准对２种药物的联合作用效果进行评价。

ＦＩＣＩ＝ＭＩＣＡＭＩＣＡＢ＋ＭＩＣＢＭＩＣＢＡ。

式中：ＭＩＣＡ为Ａ药单用时测得的ＭＩＣ；ＭＩＣＡＢ为Ａ、Ｂ２种药联用时测得的Ａ药ＭＩＣ；ＭＩＣＢ为Ｂ药单用时测得的ＭＩＣ；ＭＩＣＢＡ为Ａ、Ｂ２种药联用时测得的Ｂ药ＭＩＣ。

表２　联合用药效果评价判定标准部分抑菌浓度指数（ＦＩＣＩ）判定标准ＦＩＣＩ≤０．５协同０．５＜ＦＩＣＩ≤１相加１＜ＦＩＣＩ≤２无关ＦＩＣＩ＞２拮抗２　结果与分析２．１　黄连免煎颗粒与硫酸庆大霉素联合作用结果黄连免煎颗粒与硫酸庆大霉素联合对１６ＳｒＲＮＡ甲基化酶ＲｍｔＢ耐药重组菌的作用结果见表３。

由表３可知，黄连单的最低抑菌浓度为２０ｍｇ／ｍＬ，庆大霉素单的最低抑菌浓度为５１２μｇ／ｍＬ，黄连与庆大霉素的联合最低抑菌浓度为５ｍｇ／ｍＬ，庆大霉素与黄连的联合最低抑菌浓度为２５６μｇ／ｍＬ。

代入计算公式ＦＩＣＩ＝ＭＩＣ黄连ＭＩＣ黄连－庆大，即ＦＩＣＩ＝５０００２００００＋２５６５１２，得到ＦＩＣＩ为０．７５，二者具有相加作用。

表３　黄连与硫酸庆大霉素联合对１６ＳｒＲＮＡ甲基化酶ＲｍｔＢ耐药重组菌的作用结果黄连浓度（ｍｇ／ｍＬ）庆大霉素浓度（μｇ／ｍＬ）２０４８１０２４５１２２５６１２８６４３２黄连单肉汤菌液１６０－－－－＋＋＋－－＋８０－－－－＋＋＋－－＋４０－－－－＋＋＋－－＋２０－－－－＋＋＋－－＋１０－－－－＋＋＋＋－＋５－－－－＋＋＋＋－＋２．５＋＋＋＋＋＋＋＋－＋庆大单－－－＋＋＋＋－＋ＦＩＣ＝黄连联合ＭＩＣ／黄连单ＭＩＣ＋庆大联合ＭＩＣ／庆大单ＭＩＣ＝５×１０００／２０×１０００＋２５６／５１２＝０．７５（相加）２．２　五倍子免煎颗粒与硫酸庆大霉素联合作用结果五倍子免煎颗粒与硫酸庆大霉素联合对１６ＳｒＲＮＡ甲基化酶ＲｍｔＢ耐药重组菌的作用结果见表４。