【生物工程】下游技术实验报告
生物工程下游技术
d. 对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应 加入还原剂（如DTT、GSH、β-ME）打开蛋 白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目 标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫 键的杂蛋白会影响包涵体的溶解。 e. 同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或 EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以 防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。
优点： ① 一定的选择性； ② 细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一 步分离过程 缺点：（只能用于实验室） ① 产物抑制造成效率低下； ② 溶酶价格高； ③ 通用性差， 不易确定最佳条件；
6、微波加热法
• 机理：微波加热导致细胞内极
性物质，尤其是水分子吸收微波 能，产生大量热量，使胞内温度 迅速上升，液态水汽化产生的压 力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成 微小孔洞，进一步加热可导致细 胞内部和细胞壁水分减少，细胞 收缩，表面出现裂纹。
缺点：复性活性回收率低，而且难与杂蛋白分
离。稀释法大大增加溶液体积，不利于后续的
分离纯化，且处理量太大，不利于工业放大 ；
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体； 超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染。
2、高蛋白浓度下的复性方法：
（一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍
能得到较高的复性率。）
①缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到 复性缓冲液中,使得蛋白质在加入过程中或 加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性。 因为完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠 的蛋白一起聚集。
团状、丝状真菌、 几乎所有的微生物 较小革兰阳性菌不 细胞，包括含有包 宜，包含体不宜 含体的基因工程菌 的破壁
X-Press挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却 至-25～-30℃，形成冰晶，用500MPa以上
《生物工程下游技术实验》项目一
《生物工程下游技术实验》讲义实验项目一：“超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术”实验一：植物超氧化物歧化酶（SOD）活性测量(6学时)过程1.每组30g绿豆,洗涤，蒸馏水浸泡过夜，倒去浸泡的水，加入300 ml蒸馏水液，匀浆机匀浆，二层纱布过滤，离心（3000 rpm）得清液，取少量清液进行SOD活性及蛋白质含量测量，计算材料中SOD总活性单位及比活性单位（units/mg Pr）。
2.所得清液测量其总体积，缓慢加入硫酸铵至35%饱和度（查一般实验手册,约19.4g/100ml清液），5℃冰箱中静置备用下一实验。
SOD活性的测定：（二种方法取一种，本次实验用前者，要求理解后者的原理）●邻苯三酚自氧化法：这是最简单的一种检测方法，但干扰因素较多。
●NBT光化还原法：比较稳定，但受酚类物质干扰。
一、利用连苯三酚自氧化测SOD活性的方法溶液配制：1，连苯三酚：630 mg------→100 ml 10 mmol/L HCl (0.085 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成100 ml)。
共配500ml.2，pH 8.30 50 mmol/L Tric-HCl：A) 0.1 mol/L Tris: 12.114g-----1000 ml (储备液)B) 0.1 mol/L HCL: 浓盐酸稀释得到（8.5 ml 36%的浓HCl ，用蒸馏水配成1000 ml）(储备液)●0.05mol/L pH 8.3: 500ml A+199ml B-------定容到1000ml..操作：25︒C，3 ml 50 mmol/L pH8.30 的Tric-HCL 缓冲液，加入10 μl 50 mmol/L 连苯三酚（具体加入量应每次测量前校正，加入的原则是使下面的A325变化控制在0.07 ／min左右），迅速摇匀，倒入光径1 cm的比色杯(应该用石英杯)中，每３０秒测一次Ａ３２５值，自氧化速率的变化（∆Ａ）控制在0.07 ／min左右，加入酶液后再测连苯三酚自氧化速率的变化（∆Ａ’），酶量的加入控制在使加样后的∆Ａ’在0.035/min左右。
生物工程下游技术
生物工程下游技术生物工程下游技术生物工程下游技术的定义指从动植物与微生物的有机体或器官、生物工程产物（发酵液、培养液）及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质的技术过程。
实质：是研究如何从混合物中把一种或几种物质分离出来的科学技术。
1.生化工程分离技术预处理结晶干燥离心法：离心过滤、离心沉降、超离心萃取法：有机溶剂、双水相、液膜、反胶团、超临界层析法：凝胶过滤层析、反相层析、亲和、疏水相互作用、聚焦、离子交换膜分离：微滤、超滤、反渗透、透析、电渗透2.生物物质常用的分离技术氨基酸：结晶和离子交换法蛋白质和多肽：离子交换层析、电泳糖类：吸附层析脂质：有机溶剂萃取、超临界流体萃取和层析抗生素：有机溶剂萃取、离子交换、结晶和吸附层析3. 生物分离方法的选择与评价原则：步聚少，次序合理，产品规格（注射，非注射），生产规模，物料组成，产品形式，产品稳定性，危害性，物性：溶解度、电荷、分子大小、功能团、稳定性、挥发性，废水处理4.浓缩率：浓缩程度一般用浓缩率(concentration factor)表达，是一个以浓缩为目的的分离过程的最重要指标。
浓缩率为m，mt=mx则目标产物未得到任何程度的分离纯化。
5.分离因子：分离因子又称分离系数。
产品中目标产物浓度越高，杂质浓度越低，则分离因子越大，分离效率越高。
6. 回收率：无论是以浓缩还是以分离为目的操作过程，目标产物均应以较大的比例回收, 回收率R：生物分离操作多为间歇过程（分批操作），若原料液和产品溶液的体积分别为VC和VP。
1 生物产品与普通化工产品分离过程有何不同？2 设计生物产品的分离工艺应考虑哪些因素？3 分离纯化的回收率与浓缩率如何计算？4 现代生物分离工程研究方向有哪些特点？5 分离纯化指标有哪些?简述pH对发酵液过滤特性的影响，并举例说明。
答：（1） pH直接影响发酵液中某些物质的电离程度和电荷性质，因此适当调节pH值可以改善发酵液的过滤特性。
生物工业下游技术
电场
含尘废气净化
五、生物工业下游技术的发展动态
——成本、质量、环保将是该技术发展方向和动力 成本、质量、
1. 传统术经过改造提高后， 适合于大规模工业化生产的传统技术经过改造提高后， 适应面更宽，效率会更高，仍然显示出强劲的生命力。 适应面更宽，效率会更高，仍然显示出强劲的生命力。 各种新型高效的过滤机械和离心机械的问世， 各种新型高效的过滤机械和离心机械的问世，结晶理 论和离子交换技术的新进展，提高了产品的收率、 论和离子交换技术的新进展，提高了产品的收率、质量 和生产效率。 和生产效率。
对基因工程产品还应注意生物安全（biosafety）问题， 对基因工程产品还应注意生物安全（biosafety）问题， 要防止菌体扩散，一般要求在密封的环境下操作。 要防止菌体扩散，一般要求在密封的环境下操作。
三、生物工业下游技术的发展历程
1. 古代酿造业
古代酿造业包括酿酒、制酱（ ）、醋 酸奶和干酪等。 古代酿造业包括酿酒、制酱（油）、醋、酸奶和干酪等。技术原 家庭式作坊、产物基本不经过后处理而直接使用，无下游技术。 始、家庭式作坊、产物基本不经过后处理而直接使用，无下游技术。
生物工业下游技术
主讲 陈世伟
第一章
绪论
一、下游加工过程在生物技术中的地位
下游技术（工程） 下游技术（工程） （downstream processing）：对于由 ） 生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、 生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组 织培养的、 织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原 经提取分离、加工并精制目的成分， 料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产 品的技术。 品的技术。
2. 新技术的研究开发
生物工程下游技术
生物工程下游技术第五章1、目标产物分离基本的两个阶段：产物的初级分离和产物的纯化精制阶段。
（1）初级分离：位于生物反应之后，其任务是分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解包涵体，复原蛋白质，浓缩产物和去除大部分杂物等。
（2）纯化精制：在初级分离的基础上，用各种高选择手段（主要是各种色谱层析）将目标产物和干扰杂物尽可能的分离开，达到产物的高纯度，最后储藏运输和使用产品。
（1）机械破碎（高压匀浆、高速研磨）—离心法提取包含体—加变性剂溶解—除变性剂复性特点：利用了包含体与细胞碎片的密度差，离心法可获得干净的包含体，再对其复性。
这样首先摆脱了大量的杂质，使后面的分离纯化简单了，缺点是需要经过几次离心，加工时间较长（2）机械破碎—膜分离除可溶性蛋白—变性剂溶解包含体—除变性剂复性特点：应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，但细胞碎片与包含体一起被膜挡住，难以分开，其次膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白的滞留，优点是封闭式操作，不污染环境也不受污染，能量也消耗少（3）化学破碎（加变性剂）—离心除细胞碎片—除变性剂复性特点：化学法破菌，试剂既可以破菌又可以溶解包含体，这样节约了时间和设备，缺点是所有的可溶性杂质都没有被除去，混杂在产物中间，给后面的分离带来困难。
第六章1、膜分离技术：是用半透膜作为选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中其他组分从而达到分离目的技术。
优点：1）处理效率高，设备易于放大2)可在室温或低温下操作，适宜于热敏感物质分离浓缩3）化学与机械强度小，减少失活4）无相转变，省能5）有相当好选择性，可在分离、浓缩的同时达到部分纯化目的6）选择合适膜与操作参数，可得到较高回收率7）系统封闭循环，防止外来污染8）不外加化学物，减少了成本，也减少了对环境的污染2、膜的清洗：物理方法和化学方法。
物理方法一般是指用高速水冲洗，海绵球机械擦洗和反洗等，他们的特点是简单易行。
化学清洗通常是用化学清洗剂，如碱、酸、酶表面活性剂、络合剂和氧化剂等。
生物工程下游技术
组员：段鹏 黄锦鸾 冷雪梅 李楚英 李宪美 林 霓 林锦淳
一、背景和现状
• 目前全世界蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已 远远超过了现有生产能力。 • 当前被FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生 产工艺占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培 养，工艺设计是流加或灌流培养。 • 其大规模细胞培养生产所面临的挑战，是获得最大 生产力的同时注重维持产品的质量；去除所有培养 环境中外源因子的污染，更为精确有效的工艺控制 手段，规模化培养中氧气的限定与溶解CO2浓度累 积的控制等。 • 人们发现利用动物细胞大规模培养技术来生产大分 子药用蛋白比原核细胞表达系统更有优越性。
三、应用
• 1 生产疫苗方面
三、应用
• 2 生产药品方面
4、具体例子
• 乙型肝炎疫苗
• 乙型肝炎是由乙肝病毒引起的，约占所有 病毒性肝炎的40%，我国乙肝慢性病毒携带 者约有一亿人，是对公共卫生的一个重要 威胁。
4、具体例子
• 已被批准的乙肝工程疫苗有两种宿主细胞的，一种 是酵母表达的，另一种是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表 达的 • 任贵方等用CHO细胞表达的疫苗： （1）微载体篮式生物反应器连续灌注培养CHO细胞 （2）14000r/min连续离心去除细胞残骸提取上清 （3）经Butyl S Sepharose Fast Flow 疏水柱层析— Sephadex G 25脱盐—DEAE Sepharose Fast Flow阴离 子交换柱层析—Sepharose 4 Fast Flow 凝胶过滤，得 纯品
二、细胞培养生产优势
• 1 同源性：直接进行翻译后加工，蛋白质课 直接折叠成正确的构象翻译后修饰糖基化， 与天然产品一致 • 2 有利于产品的分离纯化：分泌胞外、纯化 方便 • 3 动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工 艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支 持技术平台，以缩短产品工艺研发的时间， 加快工业化进程。
生物工程下游技术
1.请描述生物工程下游技术的一般工艺流程，并分析各步可采用方法及其原理按生产过程分，下游技术工艺过程大致可分为4个阶段，即预处理、提取（初步分离）、精制（纯化）、成品制作。
发酵液→预处理→细胞分离→细胞破壁→碎片分离→提取→精制→成品制作加热过滤匀浆法离心沉淀(重)结晶浓缩调PH 离心研磨法双水相吸附离子交换干燥絮凝膜分离酶解法膜分离萃取色谱分离无菌加工超滤膜分离成型结晶（1）预处理和固液分离加热法：加热可降低液体黏度，只适用于产物对热较稳定的发酵液。
在适当的温度和受热时间下可使菌体或蛋白质凝聚形成较大颗粒的凝聚物，改善发酵液固液分离特性。
加热是蛋白质变性凝固的有效方法。
调节PH法：PH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，调节PH可以改变菌体和蛋白质的带电性质，从而改变其过滤特性。
蛋白质属于两性电解质，两性电解质在溶液中的PH处于等电点时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加溶解度最小。
因此，调节溶液的PH，可使蛋白质溶解度下降而析出，这是除去蛋白质的有效方法。
改变PH，还能使蛋白质变性凝固。
絮凝：在某些高分子絮凝剂的存在下。
基于桥架的作用，使胶粒形成絮凝团的过程。
（2）提取（初步分离）沉淀：在溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，生成无定形固体从溶液中析出的过程。
原理：沉淀分离就是通过沉淀，在固-液分相后，除去留在液相或沉积在固相中的非必要成分。
吸附：吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。
吸附的原理：固体内部分子所受分子间的作用力是对称的，而固体表面分子所受力是不对称的。
向内的一面受内部分子的作用力较大，而表面向外一面所受的作用力较小，因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。
萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。
原理：利用各物质在不同溶剂中具有不同的溶解度的原理来达到将目标产物分离纯化的目的。
生物工程下游技术
生物工程的下游技术上游：菌种，基因工程，分子生物学，遗传学中游：微生物发酵工程，动植物细胞，海洋生物培养下游：生物分离工程生物下游加工过程是指目标产物的分离纯化过程，包括产物提取，产物浓缩，产物纯化，成品化。
生物反应器：生物反应器是利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，是一种生物功能模拟机，如发酵罐、固定化酶或固定化细胞反应器等。
直接测定法细胞干重法：测量细胞浓度的最基本方法。
显微计数法：显微镜和血球计数器。
平板计数法：生理盐水稀释，记录菌斑。
浊度法：波长600-700nm范围测量。
微生物的浓度即菌体浓度的表示方法。
（g/l,kg/m3)间接测定法测定构成细胞的大分子物质来确定细胞浓度。
动物细胞形态成纤维细胞型；上皮细胞型；游走细胞型；多形性细胞型，均属于贴壁依赖型细胞，培养这类细胞时，常需贴附在支持物上生长。
但由于培养环境的变化，细胞形态常发生改变。
悬浮型细胞这类细胞常呈圆形，不贴附在支持物上，呈现悬浮状态生长。
如血液细胞，淋巴组织细胞及肿瘤细胞。
培养这类细胞也可采用微生物培养的方法进行悬浮物培养。
动物细胞培养的环境：温度、PH值、营养成分、溶氧、气体环境、渗透压以及其他因素。
固定化培养是既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式，具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点。
由于所培养的细胞的不同，固定化培养的方式也有不同，一般对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋，而对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。
常用的细胞固定化的方法1、吸附：选择适当的条件，将细胞和支持物混合，细胞便贴附在支持物的表面。
2、共价贴附：细胞和支持物通过化学键结合，减少了细胞泄露。
3、离子/共价交联：如果用聚合物（聚氨等）处理细胞悬液，则会在细胞之间形成桥使之絮结。
4、包埋：此法步骤简单，条件温和，细胞和高聚物或单体混合，随着凝胶的形成，细胞嵌入到高聚物网络中。
生物工程下游技术
生物工程下游技术课程名称：生物工程下游技术课程代码：6705第一部分课程性质与目标一、课程性质与特点生物工程下游技术这门课程适合于理工科专业生物工程专业进行学习。
本课程的内容更多的涉及到工业应用。
下游技术是关于由生物界自然产生的生物体或者由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应、微生物转化等各类生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，也称之下游工程或者下游加工过程，是生物技术产品产业化的必经之路。
目前所指的下游技术大多数属于“物质分离”范畴。
要紧研究的是物质分离的方法原理及有关的仪器设备。
生物工程下游技术这门课程涉及到物理，化学，生物化学，发酵工程，生物工程与设备等多门学科。
二、课程目标与基本要求通过学习生物工程下游技术这门课程应掌握下列基本知识点：1.生物工程下游技术的研究对象与进展历程2.下游技术的理论基础3.发酵液预处理，微生物细胞破碎方法与设备4.溶剂萃取与浸取，超临界流体萃取，双水相萃取，反胶团萃取，膜分离过程，液膜分离，离子交换法，色谱法等要紧分离单元操作技术及分离过程的特点，工艺设计与设备选型通过学习熟悉各类分离方法的原理，适用范围，熟悉常用分离设备的操作，在实际应用中能够选择合适的分离方法对仪器进行操作达到分离的目的。
通过学习，具备对生物产品的分离、纯化技术的应用能力，及对生物物质提纯最佳方案的设计能力。
三、与本专业其他课程的关系本课程的内容更多的涉及到工业应用。
下游技术对各类生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。
在生物工程专业课程的学习中，是一门将生物工程上游技术应用到实际生产中所需要借助的手段。
《物理学》，《无机化学》，《有机化学》，《物理化学》等基础课是这门课程的基础，《微生物学》，《生物化学》，《酶工程》，《发酵工程》，《生物工程与设备》等专业课的知识也会运用到这门课程中，其后继课程有《发酵工厂设计》等。
生物工程下游技术
优点:(1)对产物释放具有一定选择性.(2)细胞外形保持完整,碎片少,浆液粘度低,易于固液分离和进一步提取.
优点:操作参数少,适合于大规模操作,
缺点:不适合于丝状真菌及含有包涵体的基因工程菌.破碎率较低,往往需循环2-4次才能达到较高的破碎率,容易引起产物的失活的可能性,需配备换热器进行级间冷却.
3）超声破碎法:通常采用的超声破碎机在15—25kHz的频率下操作.
优点:操作简便,液量损失少,适合实验室规模.
缺点:易引起温度的剧烈上升,在大规模操作中,声能传递和散热困难,产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活.
4)酶溶法:利用酶反应,分解破坏细胞壁上的特殊键,从而达到破壁的目的.
优点:选择性释放产物,条件温和,核酸泄漏量少,细胞外形完整.
不足:价格高,限制了大规模应用,通用性差,不同菌种需选择不同的酶,不易确定最佳的溶解条件;产物抑制的存在.
倾析式离心机靠离心力和螺旋的推进作用自动连续排渣,所以也称为螺旋卸料沉降离心机.特别适用于含固形物较多的悬浮液的分离.优点:操作连续;适应性强;应用范围广;结构紧凑和维修方便缺点:分离有数较小,不适用于细菌;酵母等微生物悬浮液的分离,液相澄清度也较差.
过滤:使悬浮液通过过滤介质,让液体通过,而把固体颗粒截留,从而达到固液分离的目的.
管式离心机:分离效率很高.用于液液分离和固液分离.当用于液液分离时为连续操作,而用于固液分离时则为间歇操作.适于微生物细胞;细胞碎片;细胞器;病毒;蛋白质;核酸等生物大分子的分离.优点:设备简单,操作稳定,分离效率高.在生物工业中,特别适合于一般离心机难以分离而固形物含量＜1％的发酵液的分离.缺点:生产能力较小,转速相对较低的管式离心机最大处理量也就是10m3/h,且不适用于固形物含量较高的发酵液.
生物工程下游技术
膜分离技术【摘要】在一定流体相中，有一薄膜凝聚相物质，把液体相分隔成为两部分，这一物质称为膜。
膜本身是均一的一相或者两相以上凝聚物质所构成的复合体。
膜的厚度在0.5mm以下，具有半透明性或全透明性。
还具有高度的渗透选择性，作为一种有效的分离技术，膜传递物质的速度必须比传递其他物质快。
膜在生活及生产中有着广泛的重要的应用。
【关键词】膜特点原理应用膜分离技术是指在分子水平上不同粒径分子的混合物在通过半透膜时，实现选择性分离的技术，半透膜又称分离膜或滤膜，膜壁布满小孔，根据孔径大小可以分为：微滤膜（MF）、超滤膜（UF）、纳滤膜（NF）、反渗透膜（RO）等，膜分离都采用错流过滤方式。
膜分离技术以高效、节能、不产生二次污染等优点已在水处理领域取得了显著的工程业绩。
随着核能应用领域的扩展，在膜技术应用初期，国内外便开始了用于放射性废水的研究，目前已有多套装臵在运行，大量试验和应用结果为膜分离技术在放射性废水处理中的应用展示了广阔的前景。
我国“核电站中长期发展规划”提出，至2020年核电站装机容量达到4000万kW，目前一批核电站正在建设或论证，针对中、低浓度放射性废水的处理问题，对膜分离技术投入了更多的关注。
膜技术分离特征同种元素的同位素化学性质基本相同，这是采用膜分离技术处理放射性废水的科学依据。
技术成熟、工程经验丰富的液体分离膜技术包括电渗析(ED)、微滤(MF)、超滤(UF)、纳滤(NF)和反渗透(RO)等，分离特征见表1，要根据放射性核素的存在形态和不同膜技术的分离特征确定适宜的处理工艺。
膜分离技术处理放射性废水要与常用废水处理度浓缩，还需要蒸发过程。
对于不溶性颗粒、悬浮物和可形成胶体的核素，通过这些常用的废水处理技术，不仅可部分去除放射活性，也形成了后续膜法处理的预处理步骤。
聚集的颗粒、大分子和分子团易被微滤或超滤膜截留。
溶解性小分子或离子态放射性核素用反渗透、纳滤或电渗析进一步净化、浓缩，所用流程也与常规废水处理流程相同。
生物工程下游技术2
等电点沉淀法：对于氨基酸和蛋白质等两性物质，在酸性条件下带正电荷，在碱性条件下带负电荷，而在某一pH值下净电荷为零，称为等电点，此时两性物质的溶解度最小，此即为等电点沉淀法。
化学渗透破壁法：某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或细胞膜的通透性，从而使胞内物质有选择地渗透出来。
反渗透：在只有溶剂能通过的渗透膜的两侧，形成大于渗透压的压力差，就可以使溶剂发生倒流，使溶液达到浓缩的效果，这种操作成为反渗透。
离心分离因素：将离心加速度和自由落体加速度的比值称为离心分离因素或离心力与重力比，用公式表示为：K＝Rω2/g。
高压匀浆破壁法：将细胞悬浮在适宜的匀浆液中制成匀浆，在其尚未沉降之前，很快以高压泵将其以很高的流速喷出，这种高速喷出的浆液经过碰撞被迫改变方向而流出，细胞在这一系列过程中经历了高流速下的剪切、碰撞以及由高压到常压的变化，使细胞产生较大的形变，导致细胞壁的破坏。
超临界流体：超临界流体是状态超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点——临界点后的流体。
有机溶剂沉淀法：利用有机溶剂与蛋白质水溶液互溶，在溶解于蛋白质水溶液的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走水分子，降低水溶液的介电常数，破坏蛋白质分子表面的水化膜，从而导致蛋白质分子相互聚集发生沉淀作用。
膜组件：由膜、固定膜的支撑体、间隔物以及收纳这些部件的容器构成的一个单元称为膜组件或膜装置。
膜的水通量：即膜通量，指单位时间内通过单位膜面积的水体积流量。
膜的孔隙率：孔总面积在单位膜上所占面积的比例，空隙率越大强度越差，膜透量越大。
膜的孔径分布：膜的截留分子量：膜壁上微孔的形状和大小并非完全一致，常使用截留率和截留分子量两个参数共同来衡量，当90%的溶质被膜截留时，在截留曲线上所对应该类溶质的最小分子量即为该膜的截留分子量，用MMCO表示。
树脂工作交换容量：是表示单位质量或单位体积的树脂所能交换的离子（相当于一价离子）的物质的量。
生物工程下游技术实验（整理版）
生物工程下游技术实验（整理版）生物工程下游技术实验实验一酵母RNA的提取及含量测定（紫外吸收法）实验二黑曲霉β-D甘露聚糖酶的纯化盐析实验三盐析β-D甘露聚糖酶活力测定实验四柠檬酸摇瓶发酵及结晶提取实验一酵母RNA的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。
2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
二、实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。
一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。
其中苯酚法又是实验是最常用的。
组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。
向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。
上述方法提取的RNA 具有生物活性。
工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。
浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。
稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。
酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。
核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。
核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。
遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。
在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。
所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。
核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。
生物工程下游技术实习报告
离子交换树脂脱色
原理：离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机溶剂 的固态高分子材料。是一类带有官能团的网状结构的 高分子化合物，其结构有三部分组成：不溶性的三维 空间网状骨架，连接在骨架上的官能团和官能团所带 的相反电荷的可交换离子。 最适pH在2.5左右。
纳滤
与超滤或反渗透相比，纳滤过程对单价离子 和分子量低于200的有机物截留较差，而对二 价或多价离子及分子量介于200～500之间的 有机物有较高脱除率，基于这一特性，纳滤过 程主要应用于水的软化、净化以及相对分子质 量在百级的物质的分离、分级和浓缩（如染料、 抗生素、多肽、多醣等化工和生物工程产物的 分级和浓缩）、脱色和去异味等。 经过脱色的CPC，在纳滤膜的作用下进一步 浓缩、纯化。
发酵液的预处理和固液分离
酸化：加热、大幅度调节pH和添加絮凝剂， 使蛋白质变性，加入草酸、三聚磷酸钠等物质 除去Ca2+、Mg2+、Fe2+ 等无机离子。
微滤
• 预处理过后的发酵液 经膜过滤—微滤，除 去大部分的菌体、杂 蛋白等悬浮物质
超滤
• 在超滤过程中，水溶液 在压力推动下，流经膜 表面，小于膜孔的溶剂 （水）及小分子溶质透 水膜，成为净化液（滤 清液），比膜孔大的溶 质及溶质集团被截留， 随水流排出，成为浓缩 液。超滤过程为动态过 滤，分离是在流动状态 下完成的
结晶
结晶定义：凡是从匀相中形成固体颗粒者，统称为结 晶 结晶是制备纯品的有效方法，由于晶体外观好，易于 被消费者喜爱，一般生产中常以结晶作为最后一步的 精制操作。 比如在食品配料和添加剂都是通过结晶获得的。如葡 萄糖酸，蔗糖、谷氨酸钠等。 结晶方法有很多种，如：A. 改变温度结晶 B. 利用 等电点结晶 C. 加成盐剂结晶 D. 加入不同溶剂结 晶。 而溶析结晶是原料药最后纯化的方法。比如说对于头 孢类原料药。 如：头孢菌素C分子是利用溶析结晶法进行最后精制。
生物工程下游技术实验讲义
⽣物⼯程下游技术实验讲义⽣物⼯程下游技术实验讲义⽬录实验⼀层析柱装填及柱效测定实验⼆溶菌酶粗提取实验三溶菌酶分离纯化实验四酶活⼒及蛋⽩质浓度的测定实验五溶菌酶纯度鉴定与分⼦量测定实验⼀层析柱装填及柱效测定⼀、实验⽬的1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定⽅法；2. 熟悉凝胶层析的⼀般过程；⼆、实验原理凝胶过滤层析也称分⼦筛层析、排阻层析。
是利⽤具有⽹状结构的凝胶的分⼦筛作⽤，根据被分离物质的分⼦⼤⼩不同来进⾏分离。
相对分⼦质量⼤的⽣物分⼦由于不能进⼊或不能完全进⼊凝胶内部的⽹孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或⼤的⽹状孔通过，⼤分⼦相对于⼩分⼦迁移的路径短，保留值⼩，所以在层析过程中迁移速度最快，先从柱中流出；反之，分⼦量⼩的⽣物分⼦保留值⼤，后从柱中流出。
凝胶层析常⽤于分离纯化蛋⽩质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、病毒、氨基酸和抗⽣素等⽣物⼤分⼦, 也可⽤于样品的浓缩和脱盐及测定⽣物⼤分⼦的分⼦质量等⽅⾯。
三、实验试剂与器材层析柱（ 1.6×30 cm ），砝码天平，玻璃棒，烧杯，刻度试管及试管架，滴头吸管，Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂），⽔浴锅，蓝⾊葡聚糖四、实验内容与步骤（⼀）测量层析柱的内径、⾼度，计算所需凝胶量⼲胶⽤量（g）=柱床体积（ml）/凝胶的溶胀体积(ml/g)由上式计算出的⼲胶⽤量再增加10%-20%（⼆）Sephadex G-50凝胶预处理称取相应质量的⼲凝胶，加⼊适量的0.02 mol/L PBS 在100℃⽔浴中加热溶胀1⼩时以上，溶胀之后将极细的⼩颗粒倾泻出去。
⽤真空⼲燥器抽尽凝胶中空⽓，并将凝胶上⾯过多的溶液倾出。
（三）层析柱的装填1 清洗：每组取⼀⽀层析柱，⽤清⽔冲洗⼲净。
2 安装与检查：检查柱下部烧结滤板是否完好⼲净。
安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。
对准出⼝处，放⼀只250mL烧杯。
生物下游技术实验!!!!
生物下有技术期末大实验一、实验目的：1、熟练酵母扩大培养的技术。
2、学习酵母蔗糖酶的提取方法以及原理。
3、了解双缩脲法测蛋白质含量。
二、酵母的扩大培养:●一级培养：取新鲜苹果汁液，分装在两只经过杀菌的试管中，每只装量10~20毫升，加绵塞。
在0.06~0.10兆帕压力下杀菌30分钟，冷却至常温，接入纯酵母菌1~2针，摇动分散，在25~28摄氏度下培养24~48小时，使发酵旺盛。
●二级培养：用杀过菌的三角瓶（1000毫升），装鲜果汁500毫升，如上法杀菌，接入培养旺盛的试管酵母液两支，在25~28 摄氏度下培养24~28小时，待发酵旺盛期过后使用。
三、酵母蔗糖酶的提取（一）、部分纯化试剂：1 ．啤酒酵母2 ．一氧化硅3 ．甲苯（使用前预冷到0 ℃以下）4 ．去离子水（使用前冷至4 ℃左右）5 ．冰块、食盐6 . 1N 乙酸7 . 95 ％乙醉（二）、仪器：1 ．研钵1 个2 ．离心管3 个3 ．滴管3 个4 ．量筒50ml 1个5 ．水浴锅1 个6 ．恒温水浴7 ．烧杯1000ml 2个8 ．广泛pH 试纸9 ．高速冷冻离心机（三）、操作步骤：1 ．提取（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。
（2）称取5g 干啤酒酵母和20g 湿啤酒酵母，称20mg 蜗牛酶及适最（约10g）一几氧化硅，放入研钵中．二氧化硅要预先研细。
（3）量取预冷的甲苯3Oml 缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60 分钟．研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。
（4）缓慢加入预冷的40ml 去离了水，每次加2ml 左右，边加边研磨，至少用30 分钟。
以便将蔗糖酶充分转入水相。
（5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4 ℃, 4000rpn ，30min 。
如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。
用滴管吸出上层有机相．（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，4000rpn，离心30min 。
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华南师范大学实验报告学生姓名：黎嘉俊学号：20102500008专业：生物工程年级、班级：10工程一班课程名称：生物工程下游技术实验实验项目：黑曲霉β-D甘露聚糖酶的纯化实验类型：□验证□设计□综合实验时间：2013年9月17日实验指导老师：江学文实验评分：一．实验目的1、粗酶的制备2、硫酸铵分级沉淀3、透析袋的处理方法和使用二．原理1、盐析原理：中性盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化层逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。
2、透析袋脱盐：酸性β-甘露聚糖相对分子质量为39000和40000，选择MWCO （切割分子量或截留分子量）14000的透析袋，透过掉分子量小于1000的蛋白质；并借助分子扩散脱盐。
三．实验试剂和器材纱布1卷、脱脂棉1包、琼脂条1包、透析袋MWCO（分子量） 7000 四．实验步骤1、将黑曲霉ASP.Niger 菌株斜面接种三角瓶固体发酵培养基,30.5℃恒温培养72 h。
2、称取10克发酵麸曲，加100毫升pH5.6的醋酸缓冲液，温度35.2℃，转速135rpm，摇床摇60 min后，用￠15㎝滤纸过滤。
3、取滤液40毫升，在不断搅拌下分步加入（NH4）2SO422.0克（待加入部分溶解后再加入剩余部分）。
4、置冰箱中5℃下静止沉淀过夜。
5、标准曲线的绘制：分别吸取0.1%标准甘露糖溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，分别定容至50ml。
再分别吸取上述溶液各 2.5ml于试管中各加2.5ml3,5-二硝基水杨酸显色液（DNS试剂），煮沸5min（另作1管对照，取2.5ml蒸馏水，加2.5mlDNS试剂，同样煮沸5min）。
冷却后，用721型分光光度计在530nm波长下比色，记录各管的光密度值，以光密度作纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。
五．实验结果六．分析与讨论（1）本次实验的第一步是标准曲线的制作，在使用分光光度计测定OD值时发现，加入的0.1%标准甘露糖溶液体积为10ml的比色管的试样测出的OD值略大，正常来说OD值若大于1.5时虽进行稀释否则误差较大。
据分析多组的数据显示装有10ml的试样测出的OD值多数超过1.5，可能是试样浓度太大引起，但超出范围较小，在可以接受的范围内，而且曲线的上升趋势仍然正常，没有出现较大程度的偏离，相关系数为0.952，而且图中个点的位置都在标准曲线的附近并没有偏离太多，均匀分布在曲线的两端，结果比较理想，因而该曲线符合实验的要求。
（2）本实验的第二步为转速135rpm，摇床摇60 min后，用￠15㎝滤纸过滤，耗时较长而且效果不太好，可以采用高速离心，转速8000rpm，10min，溶液分层明显，然后直接用滤纸过滤仍然有较好效果，且耗时短，过滤时如遇到过滤较难的情况，可以更换滤纸继续操作。
（3）实验的第三步是取滤液40毫升，在不断搅拌下分步加入（NH4）2SO422.0克，待加入部分溶解后再加入剩余部分，否则不能沉淀出绝大多数的蛋白质，影响实验的结果，造成误差。
七．思考题1、（NH4）2SO4沉淀蛋白质的原理是盐析，与其它盐相比其优点有那些？答：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。
除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。
盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备。
②操作简单、安全。
③对许多生物活性物质具有稳定作用。
中性盐沉淀蛋白质的基本原理：蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。
亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。
因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。
由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。
由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类。
2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。
有的酶或蛋白质用2～3mol/L 浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。
4) 价格便宜，废液不污染环境。
2、影响盐析的因素有那些？答：盐析的影响因素①蛋白质的浓度：中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。
通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。
对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。
通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当25mg/mL～30mg/mL。
②pH 值对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。
改变pH 值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。
远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH 值常选在该蛋白质的等电点附近。
③温度的影响：温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。
在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。
在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行，但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。
华南师范大学实验报告学生姓名：黎嘉俊学号：20102500008专业：生物工程年级、班级：10工程一班课程名称：生物工程下游技术实验实验项目：盐析β-D甘露聚糖酶活力测定实验类型：□验证□设计□综合实验时间：2013年9月24日实验指导老师：江学文实验评分：一．实验目的1、掌握β-D甘露聚糖水解各种甘露聚糖之间β糖苷键的机制和理论。
2、掌握以魔芋精粉为底物测定发酵制品中β-D甘露聚糖活力的操作方法。
二．基本原理水解含B一1，4甘露糖苷键的甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等)的内切水解酶，属于半纤维素酶类。
B一甘露聚糖酶能将广泛存在于豆类籽实中的甘露聚糖降解为甘露低聚糖，不仅消除了甘露聚糖对单胃动物的抗营养作用，同时生成的甘露低聚糖在动物肠道中起着重要的调节作用。
三、实验试剂和器材721型分光光度计、恒温水浴锅、秒表。
pH5.6的醋酸缓冲液四、实验步骤1、倾去部分上清液，立即将沉淀部分在4000rpm，离心10min。
收集沉淀，加约20毫升蒸馏水溶解，倒入事先准备好的透析袋中。
（透析袋处理：剪成15㎝长度，沸水浴中煮10min，捞起、扯开，在一端1㎝处用细绳扎紧口，用水试一下是否有漏，若有漏需重新绑扎，直至不漏为止。
处理过程中需戴手套！）2、酶液倒入透析袋后，另一端1㎝处也用细绳（应用长一点的！）扎紧口，浸于4～5℃的蒸馏水中（250ml烧杯），持续时间1.0h，并不时搅拌，期间每隔20min更换1次4～5℃的新鲜蒸馏水，以利迅速达到平衡，每次用水量约150毫升。
注：1、上端口切不可浸于水中，以免水进入袋中胀破透析袋！2、透析同时可准备2支50ml的比色管，各加0.25g魔芋精粉，加25mlpH5.6的醋酸缓冲液溶解。
操作顺序：先量取25mlpH5.6的醋酸缓冲液加入比色管，在55℃水浴预热，再分次、少量将0.25g魔芋精粉加入，待先加的溶解后再加剩下的！溶解完毕，将2支溶有魔芋精粉的50ml比色管始终置于55℃水浴中预热，等待酶解。
3、将透析好的酶液透析袋置于玻璃漏斗上，解开上端口细绳或剪去上端口一部分，但不要使酶液流出！）。
4、2支溶有魔芋精粉的50ml比色管，1支加透析好的酶液2ml；另1支加灭活的透析酶液2ml（用做对照），55℃水浴下反应10 min，取出，立即进行下面操作：事先准备2支50 ml的比色管，1支加4.5ml DNS试剂，立即加1.5ml酶解反应液；另1支加4.5ml DNS试剂，立即加1.5ml对照管的酶解反应液，2管同时沸水浴5 min后，定容至10ml ,于530 nm处测定光吸收值。
在本实验条件下,定义每10 min产生1 mg还原糖的酶量为一个单位。
（酶液灭活：取5毫升透析酶液置于10 ml的比色管，沸水浴15 min。
）五、实验结果计算β-D 甘露聚糖酶活力 252011.54227/2520B n B g ml n μ⨯⨯⨯⨯⨯----酶活力(u/g 湿基）)=所测吸光度值在标准曲线上的葡萄糖；测吸光度时比色管定容体积，ml ；溶解沉淀的体积,ml ；2-水解消耗的酶液体积；反应液稀释倍数；4-与盐析沉淀的滤液量相当的曲料量，g （湿基）∵Y=（样本OD 值-样本空白OD 值）=2.522∴Y=0.1544x→x=Y/0.1544=2.522/0.1544≈16.33ml又∵0.1%标准甘露糖溶液浓度为1mg/ml∴酶活力（u/g湿基）=×又∵反应液的稀释倍数n=20/(2/6×1.5)=40B=16.33ml×1mg/ml×103=16330∴酶活力（u/g湿基）=×=16330×10×20×40/（2×1.5/27）×1/4≈2.9394×108u/g六、分析与讨论(1)本次实验是基于第一次实验的标准曲线的基础上进行的，在测量OD值的时候不需要用第一次实验的空白对照，因为测量出来的样本OD和样本空白OD相减能消去空白OD的值，因而可以把样本空白OD作为对照，调零操作，直接能显示样本OD减去样本空白OD的结果作为实验的结果。
本次实验测量的结果偏大，有第一台仪器测量能达到4.0，另一台仪器的结果比较合适，为2.520左右，但仍比正常的数值偏大很多，数值不在实验第一步得出的标准曲线上，不在标准曲线的适用范围内的数值的话，带入得出的公式误差会很大。
通常测量的OD值取用范围在1.8以内，超过该数值误差比较大，若要再进行实验最好进行稀释，测量得出的OD值再乘以稀释倍数。