pBMT-4广宿主载体使用说明

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真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控

真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。

更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。

注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。

Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。

此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。

借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。

亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。

Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+ Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。

腺病毒载体操作手册中文版解析

腺病毒载体操作手册中文版解析腺病毒载体操作手册中文版AdEasyTM操作手册目录缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍

毕赤酵母表达载体及宿主菌介绍由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。

整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。

典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。

如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。

在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。

为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。

表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。

有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。

一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。

携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。

甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。

对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。

因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。

在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。

这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。

如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。

Protein At Beads 4FF 预装柱说明书

ProteinAt Beads 4FF 的预装柱说明书货号：YA2471规格：1*1mL /1*5mL /5*1mL /3*1mL+1*5mL /5*5mL保存：2-8℃产品说明：Protein At Beads 4FF 是用于分离和纯化单克隆抗体、多克隆抗体或Fc-融合蛋白的亲和层析介质。

Protein A 是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc 片段结合哺乳动物IgG 。

Protein At Beads 4FF 的配体蛋白Protein At 是在天然蛋白A 的基础上进行生物工程突变得到的一种耐碱蛋白A(Alkaline tolerate ，故缩写为At)。

Protein At Beads 4FF 是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，可以在相对较高的流速下进行单克隆抗体和多克隆抗体的纯化。

表1：介质性能参数介质高度交联的4%琼脂糖平均粒径～90μm配体耐碱性Protein A结合载量>40mg 人lgG/ml 介质化学稳定性可耐受抗体纯化过程中的所有试剂工作pH 3-12在线清洗0.1-0.5M NaOH 线性流速50-300cm/h 保存20%乙醇纯化流程：1、Buffer 的准备所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤。

平衡/洗杂液：0.15M NaCl 、20mM Na 2HPO 4，pH7.0洗脱液：0.1M 甘氨酸，pH 3.0中和液：1M Tris-HCl ，pH 8.5。

2、样品准备上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH 值，可以用平衡/洗杂液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用平衡/洗杂液透析。

样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

3、样品纯化1.上柱：将泵管道中注满去离子水。

去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中。

再折断下口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。

pBT-5广宿主载体使用说明

pBT-5编号载体名称北京华越洋VECT75108pBT-5pBT-5载体基本信息：载体名称:pBT-5质粒类型:广宿主载体；克隆载体；原核载体高拷贝/低拷贝:--克隆方法:限制性内切酶，多克隆位点启动子:无载体大小:1979bp5'测序引物及序列:--3'测序引物及序列:--载体标签:--载体抗性:甲氧氨苄嘧啶克隆菌株:DH5α等宿主细胞（系）:多个菌属备注:--组成型/诱导型:组成型pBT-5载体质粒图谱和多克隆位点信息：pBT-5载体序列：ORIGIN1aacgaattca agcttgatat cattcaggac gagcctcaga ctccagcgta actggactga 61aaacaaacta aagcgccctt gtggcgcttt agttttgttc cgcggccacc ggctggctcg 121cttcgctcgg cccgtggaca accctgctgg acaagctgat ggacaggctg cgcctgccca 181cgagcttgac cacagggatt gcccaccggc tacccagcct tcgaccacat acccaccggc 241tccaactgcg cggcctgcgg ccttgcccca tcaatttttt taattttctc tggggaaaag 301cctccggcct gcggcctgcg cgcttcgctt gccggttgga caccaagtgg aaggcgggtc 361aaggctcgcg cagcgaccgc gcagcggctt ggccttgacg cgcctggaac gacccaagcc 421tatgcgagtg ggggcagtcg aaggcgaagc ccgcccgcct gccccccgag cctcacggcg 481gcgagtgcgg gggttccaag ggggcagcgc caccttgggc aaggccgaag gccgcgcagt 541cgatcaacaa gccccggagg ggccactttt tgccggaggg ggagccgcgc cgaaggcgtg 601ggggaacccc gcaggggtgc ccttctttgg gcaccaaaga actagatata gggcgaaatg 661cgaaagactt aaaaatcaac aacttaaaaa aggggggtac gcaacagctc attgcggcac 721cccccgcaat agctcattgc gtaggttaaa gaaaatctgt aattgactgc cacttttacg 781caacgcataa ttgttgtcgc gctgccgaaa agttgcagct gattgcgcat ggtgccgcaa 841ccgtgcggca ccctaccgca tggagataag catggccacg cagtccagag aaatcggcat 901tcaagccaag aacaagcccg gtcactgggt gcaaacggaa cgcaaagcgc atgaggcgtg 961ggccgggctt attgcgagga aacccacggc ggcaatgctg ctgcatcacc tcgtggcgca 1021gatgggccac cagaacgccg tggtggtcag ccagaagaca ctttccaagc tcatcggacg 1081ttctttgcgg acggtccaat acgcagtcaa ggacttggtg gccgagcgct ggatctccgt 1141cgtgaagctc aacggccccg gcaccgtgtc ggcctacgtg gtcaatgacc gcgtggcgtg 1201gggccagccc cgcgaccagt tgcgcctgtc ggtgttcagt gccgccgtgg tggttgatca 1261cgacgaccag gacgaatcgc tgttggggca tggcgacctg cgccgcatcc cgaccctgta 1321tccgggcgag cagcaactac cgaccggccc cggcgaggag ccgcccagcc agcccggcat 1381tccgggcatg gaaccagacc tgccagcctt gaccgaaacg gaggaatggg aacggcgcgg 1441gcagcagcgc ctgccgatgc ccgatgagcc gtgttttctg gacgatggcg agccgttgga 1501gccgccgaca cgggtcacgc tgccgcgccg gtagtacgta agaggttcca actttcacca 1561taatgaaata agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt caggagctaa 1621ggaagctaaa atgggtcaaa gtagcgatga agccaacgct cccgttgcag ggcagtttgc 1681gcttcccctg agtgccacct ttggcttagg ggatcgcgta cgcaagaaat ctggtgccgc 1741ttggcagggt caagtcgtcg gttggtattg cacaaaactc actcctgaag gctatgcggt 1801cgagtccgaa tcccacccag gctcagtgca aatttatcct gtggctgcac ttgaacgtgt 1861ggcctaagaa tggatccccc tcaagtcaaa agcctccggt cggaggcttt tgactttctg 1921ctatggaggt caggtatgat ttaaatggtc agtattgagc gatatctaga gaattcgtc //pBT-5其他相关广宿主载体：pMHE3Tc pCS2+8pCSDest pSPORT2pMHE5Tc pMHE7Tc pMHE7pMHE6pMHE5pMHE3pMHE2pBBR1MCS-6 pBBR1-GFP pBMTB-5pBMTB-4pBMTB-3pBMTB-2pBMTB-1pBTL-5pBTL-4pBTL-3pBTL-2pBTL-1pBTB-5pBTB-4pBTB-3pBTB-2pBTB-1pBT-5pBMT-5pBMT-4pBMT-3pBMT-2pBMT-1pBT-4pBT-2pBT-3pBT-1pCS2+MT pCS2+8CmCherry pCS2+8CeGFP pMMB207pCS22+pCS2+pCS2-pCS111pCS108pCS107pBBR1MCS pBBR1MCS-5pBBR1MCS-4pBBR1MCS-3 pBBR1MCS-2。

pBBR1MCS-spe使用说明

pBBR1MCS-spe编号载体名称北京华越洋VECT75492pBBR1MCS-spepBBR1MCS-spe载体简介：广宿主穿梭质粒pBBR1MCS-spe是基于质粒pBBR1MCS构建的[1]，该质粒是由Kovach等构建，已经证实可以在许多革兰氏阴性菌中进行复制[2]，包括Acetobacter xylinum、Alcaligenes eutrophus、Bartonella bacilliformis、百日咳杆菌（Bordetella spp.）、布鲁氏菌（Brucella spp.）、Caulobacter crescentus、大肠杆菌、Paracoccous denitrificans、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、恶臭假单胞菌（P.putida）、苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti）、R.leguminosarum by.Viciae、球形红假单胞菌（Rhodobacter sphaeroides）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）和Xanthomonas campestris等。

[1]Kovach ME,et al.pBBR1MCS:a broad-host-range cloning vector. Biotechniques,1994,16(5):800-802.[2]Kovach ME,Elzer PH,Hill DS,et al.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying differentantibiotic-resistance cassettes.Gene,1995,166:175-176pBBR1MCS-spe载体其他相关的链霉菌载体：pBBR1MCS2-pAmp-EGFPpBBR1MCS-spe pBBR1MCS-5 pBBR1MCS-4 pBBR1MCS-3 pBBR1MCS-2 pBBR1MCS-1。

真核细胞常见表达载体

真核细胞罕睹表黑载体之阳早格格创做真核细胞, 表黑载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特性:该真核细胞表黑载体分子量为6600碱基对于，主要由CMVp开用子、兔β-球蛋黑基果内含子、散腺嘌呤、氨青霉素抗性基果战抗neo基果以及pBR322骨架形成，正在大普遍真核细胞内皆能下火稳牢固天表黑中源手段基果.更要害的是，由于该真核细胞表黑载体中抗neo基果存留，转染细胞后，用G418筛选，可修坐宁静的、下表黑手段基果的细胞株.拔出中源基果的克隆位面包罗Sal1、BamH1战EcoR1位面.注意正在此载体中有二个EcoR1位面存留.2、pEGFP, 巩固型绦色荧光蛋黑表黑载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特性: pEGFP表黑载体中含有绿色荧光蛋黑，正在PCMV 开用子启动下，正在真核细胞中下火仄表黑.载体骨架中的SV40origin使该载体正在所有表黑SV40 T抗本的真核细胞内举止复造.Neo抗性盒由SV40早期开用子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基果以及HSV-TK基果的散腺嘌呤旗号组成，能应用G418筛选宁静转染的真核细胞株.别的，载体中的pUC origin 能包管该载体正在大肠杆菌中的复造，而位于此表黑盒上游的细菌开用子能启动kanamycin抗性基果正在大肠杆菌中的表黑.用途: 该表黑载体EGFP上游有Nde1、Eco47111战Age1克隆位面，将中源基果扦进那些位面，将合成中源基果战EGFP的混合基果. 借此可决定中源基果正在细胞内的表黑战/或者构造中的定位.亦可用于检测克隆的开用子活性(与代CMV开用子,Acet1-Nhe1).3、pEGFT-Actin, 巩固型绿色荧光蛋黑/人肌动蛋黑表黑载体特性:pEGFP-Actin表黑载体中含有绿色荧光蛋黑战人胞浆β-肌动蛋黑基果，正在PCMV开用子启动下，正在真核细胞中下火仄表黑.载体骨架中的SV40origin使该载体正在所有表黑SV40 T抗本的真核细胞内举止复造.Neo抗性盒由SV40早期开用子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基果以及HSV-TK基果的散腺嘌呤旗号组成，能应用G418筛选宁静转染的真核细胞株.别的，载体中的pUC origin 能包管该载体正在大肠杆菌中的复造，而位于此表黑盒上游的细菌开用子能启动kanamycin抗性基果正在大肠杆菌中的表黑.用途: pEGFP-Actin载体正在真核细胞表黑EGFP-Actin混合蛋黑，该蛋黑能调整到胞内正正在死的肌动蛋黑，果而正在活细胞战牢固细胞中瞅察到细胞内含肌动蛋黑的亚细胞结构.4、pSV2表黑载体特性：该表黑量粒是以病责SV40开用子启动正在真核细胞手段基果举止表黑的，克隆位面为Hind111.SV40开用子具备构造/细胞的采用特同性.此载体没有含neo基果，故没有克没有及用去筛选、修坐宁静的表黑细胞株.5、CMV4 表黑载体特性:该真核细胞表黑载体由CMV开用子启动，多克隆天区酶切位面采用性较多.含有氨苄青霉素抗性基果战死少基果片段以及SV40复造本面战fl单链复造本面.但是值得注意的是，该表黑载体没有含有neo基果，转染細胞后没有克没有及用G418筛选宁静的表黑细胞株. 其余时常使用克隆Vector：pBluscript II KS DNA 15 ugpUC18 DNA 25 ugpUC19 DNA 25 ug证明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体符合于DNA片段的克隆、DNA测序战对于中源基果举止表黑等.那些载体由于正在lacZ基果中含有多克隆位面，当中源DNA片段扦进，转移lacZ基果缺累细胞，并正在含有IPTG战X-gal的培植基上培植时，含有中源DNA载体的细胞将为红色菌降，而无中源DNA片段载体的细胞则为兰色菌降，由此易于筛选有无中源DNA片段的载体.别的，那些载体中有便于测序的M13、T7战T3的通用引物举止DNA测序. 保存液: TE BufferTE Buffer组成: 10mM Tris.HCL(Ph 8.0) 1mM EDTA用途: 克隆中源DNA片断. 举止基果表黑. 使用M13、T7战T3引物举止测序. 存留的问题细胞的死命活动是一个搀纯的调控历程，有些死命活动的机理还没有真足浑晰，由于插人的手段基果分歧，载体构修栗用的逆式组件分歧，组拆的空间位子分歧，采与的表黑系统分歧，手段基果表黑火仄易阳性克隆筛选率皆市有很大好别.其余，由于所有的逆式元件存留种属战构造特同性，所构修的下效表黑载体纷歧定正在所有细胞株中均下效表黑.再者，细胞死少状态的好别，转染要领的分歧培植时阉的少短，筛选药物浓度的下矮，对于表黑量皆有很大效率.所以，需要概括评介一个表黑载体战表黑系统，排除一些没有定果素，筛选出最好拉拢真核表黑载体趋背于既有好处扩删手段基果又有好处筛选阳性克隆的载体的构修.许多灵验的应用范畴广的强开用子战巩固子被人创造并应用于载体中，大大普及了手段基果的表黑量，其余一些强的组成型开用子，如SV40早期开用子+PHTLv，已应用于大规模死产的细胞系中. 应用以GS为筛选标记的表黑载体可兼有筛选战扩删手段基果二种功能，是暂时钻研的沉面.以IRES连交的单逆反子表黑载体已成为核表黑载体的主体.正在共一开用子把持下，筛选基果或者报告基果与手段基果转录正在共一mRNA上通过IRES的效率，表黑出二种蛋黑，果而正在表面上可认为，通过了筛选或者表黑了报告基果的克隆必为阳性克隆，即表黑手段基果的克隆，有报导道那种单逆反子的共表黑率为90％.那便大大普及了筛选率，简化了真验历程. 将强开用子、巩固子战可扩删的筛选标记组拆正在共一载体上，构修下效表黑战筛选的表黑载体并将其使用于最符合的表黑系统中，是现正在真核表黑载体构修钻研死少目标.。

构建重组表达质粒pBV220／mhNT-4及mhNT-4在大肠杆菌中的表达

构建重组表达质粒pBV220／mhNT-4及mhNT-4在大肠杆菌中的表达张华1 赵家良1胡海涛2（1.中国医学科学院北京协和医院眼科，北京1007302.西安交通大学医学院神经生物学中心，西安 710061）中文摘要：利用基因重组技术将mhNT-4亚克隆到表达载体pBV220，构建重组表达质粒pBV220／mhNT-4，诱导表达mhNT-4成熟蛋白，鉴定mhNT-4的生物活性。

将经鉴定的pGEM-T Easy /mhNT-4克隆用限制性内切酶EcoR I,BamH I消化，琼脂糖凝胶电泳回收片断。

酶切原核高表达载体pBV220，用限制性内切酶EcoR I,BamH I消化，琼脂糖凝胶电泳回收线性化载体。

用T4 DNA连接酶连结两个回收片断，构建重组质粒pBV220／mhNT-4。

限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒。

经鉴定的重组质粒pBV220／mhNT-4转染大肠杆菌DH5α，温度诱导表达mhNT-4蛋白。

SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳技术分离表达的mhNT-4蛋白。

制备8~9d鸡胚，分离并培养背根神经节(DRG)细胞。

分别加入回收的表达蛋白和牛血清白蛋白，培养鸡胚背根神经节DRG细胞，检测mhNT-4生物活性。

重组表达质粒pBV220／mhNT-4构建正确，表达框架未发生改变。

成功诱导表达、分离了mhNT-4成熟蛋白。

表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织快周缘向四周呈放射状长出，对照组未见神经突起长出。

mhNT-4成熟蛋白具有良好的生物活性。

本研究为进一步开展mhNT-4基因治疗青光眼提供了资料。

关键词：人神经营养素-4成熟蛋白基因（mhNT-4）；基因重组；表达载体；生物活性青光眼是一种严重的致盲性眼病，是一组与视野缺损有关的具有特征性视神经病变的眼部疾病，以高眼压为危险因素之一。

青光眼的视神经病变和视野缺损，与视网膜神经节细胞及其轴突在视网膜和视神经缺损相关，阐明视网膜神经节细胞死亡过程中的细胞分子变化是目前一个活跃的研究领域，正被广泛应用于视网膜神经节细胞衰亡的机制研究中，并将为青光眼治疗带来新方法。

广宿主稳定表达载体pQMV和pGMP的构建

*基金项目：国家自然科学基金青年基金（No.39900004）和国家重点基础研究发展规化(973)项目（No.2001CB109005）资助。

胡玉琴:女，1962年生，博士研究生。

Email:<yuqinhu316a@>.**通讯作者。

Author for correspondence.E-mail:<dfh313@>.收稿日期：2003-05-13接受日期：2003-06-05农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(2):202~205·研究论文·广宿主稳定表达载体pQMV 和pGMP 的构建*胡玉琴1张杰1宋福平1束长龙1黄大昉2**（1.中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100094；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京100081）摘要：以高效表达载体pET-29a 为基础，将广宿主载体pUCP19中稳定的假单胞菌（）质粒DNA 复制子和自行分离克隆的荧光假单胞菌()P303组成型表达启动子P P 303插入其中，分别获得了重组载体pQMV(4.6kb)和pGMP(5.6kb)。

它们均含有假单胞菌和大肠杆菌复制子、荧光假单胞菌内源强启动子，以及包含8~11个限制性内切酶多克隆酶切位点；此外，载体pGMP 还含有绿色荧光蛋白基因作为辅助检测标记。

连续培养和继代培养测定，这两种载体在荧光假单胞菌中的稳定性均为100%（120h ）。

关键词：绿色荧光蛋白基因；荧光假单胞菌；启动子；穿梭表达载体Construction of Stable Shuttle Expression Vectors pQMV and pGMPHU Yu-Qin 1ZHANG Jie 1SONG Fu-Ping 1SHU Chang-Long 1HUANG Da-Fang 2**(1.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests,Institute of Plant Protection,Chinese Academyof Agricultural Sciences,Beijing 100094,China;2.Biotechnology Research Institute ,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)The replicon ofplasmid DNA from pUCP19,and a new strong promoter P P 303,cloned fromP303strain,were inserted into plasmid pET-29a,a high level expression vector of.The recombinantshuttle expression plasmid pQMV(4.6kb)and pGMP(5.6kb)were obtained respectively.The vector pGMP containinggene wasespecially available for detection and monitoring.The stability of the two expression vectors were 100%(120h)in P303strain of.Both recombinant vectors will be powerful for research on gene expression,regulation and construction ofengineered strains of.green fluorescence protein gene ();;promoter;shuttle expression vector假单胞菌()是微生物的重要类群，具有很大的开发应用潜力。

常用载体构建说明书

常用载体构建说明书步骤：一、基本耗材准备（抗生素、LB液体培养基、LB固体培养基、离心管、枪头、三角瓶）二、制备感受态大肠杆菌三、设计引物四、Pcr扩增五、Pcr产物检测六、Pcr产物回收七、双酶切pcr产物和质粒八、酶切产物回收九、目的基因与载体连接十、转化感受态大肠杆菌十一、单克隆检测十二、测序比对十三、提质粒十四、酶切验证十五、转化感受态农杆菌十六、单克隆检测十七、侵染液配制一、基本耗材准备1、抗生素的制备（抗生素为索来宝公司）常用抗生素Kan（卡那）Amp（氨苄）Rif（利福平）母液浓度：Kan 50mg/ml Amp 100 mg/ml Rif 100 mg/ml工作浓度：Kan 50ng/ul Amp 100 ng/ul Rif 100 ng/ul举例：称取kan固体1g 于注射器中，加入20ml ddH2O，溶解后用过滤器注入灭过菌的离心管中，-20度保存，使用比例1:1000注意：Rif溶解时加入DMSO2、培养基的配制LB液体培养基1000ml 200ml牛肉膏5g 1g蛋白胨10g 2g氯化钠10g 2gLB固体培养基1000ml 200ml牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂粉5g10g10g15g1g2g2g3g120℃高温高压灭菌15-20min，固体培养基冷却后加入相应抗性，加入比例1:1000，然后把培养基倒90cc的培养皿中，一般情况下一个培养皿可倒20ml培养基。

3、离心管、枪头、三角瓶0.2ml、1.5ml、2.0ml离心管各200-500个，50ml离心管2个10ul、200ul、1000ul 枪头各2盒50ml、100ml、250ml 、500ml三角瓶各2个去离子水或双蒸水500ml二、制备感受态大肠杆菌（所用超级感受态细胞制备试剂盒购于上海生工）BT Media 培养基制备：1支BT Media加50 ml蒸馏水配制，放入250ml三角瓶，高压灭菌即可准备工作：将BT Buffer A和BT Buffer B 放冰上遇冷，遇冷低温离心机至4℃1、用超低温冰箱中保存的菌种在LB平板上进行划线，置37℃培养箱中静置培养12-16h待菌落生长到1-2mm大小。

载体构建步骤

一．载体酶切线性化（TOYOBO EcoR I）1.载体pCDNA浓度0.8 ug/ul2.酶切体系（总50ul体系）pCDNA 3ul10*H Buffer 5ulddH2O 41ulEcoR I 1ul（8U/ul）3.反应条件37°C 1h 至多2h*已经试过37°C过夜，本以为会酶切充分，但是不想把条带全切成小片段了，而且电泳后是一条宽宽的泳谱*另外，多次酶切证实，所加的酶量过多在酶切一小时的情况下仍然会出现酶切过度的情况，尽可能按照说明书上的量和时间做二．取2ul稀释成5ul于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定有无条带及大小用大凝胶回收pcDNA（按2.5：1加入SYBR Green）电泳30min准备两支EPPendorf管，调60°C水浴锅切胶称重（1.5ml EPPendorf管重约0.82g）三．OMEGA gel purification kit回收pcDNA1.平衡柱子加200ulBuffer GPS到DNA收集柱中，静置4min，12000xg*2min，加700ulDEPC处理H2O，12000xg*2min2.溶胶按1ml/kg的比例加Binding Buffer到凝胶中3.60°C水浴7mins，迅速转移至DNA收集柱中（至多700ul，超过的再转移一次），10000xg*1min，弃收集管中的液体4.加300ulBinding Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体5.加700ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体6.加350ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体7.最大转速（>13000rpm）空转2min，弃收集管8.转移收集柱至1.5mlEPPendorf管，打开盖子静置2min9.加30ulElution Buffer静置2min，最大转速1.5min，弃收集柱10.取2ul稀释成5ul点胶*所加Elution Buffer的量是根据所纯化的产物的量来判断的，如果回收产物较多可以增加其量至50ul*纯化的理论效率为70%，如果先加一次Elution Buffer 20ul，静置2min，1000xg*1min,然后再加一次Elution Buffer20ul，静置离心。

毕赤酵母常用培养基与载体

毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。

此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。

当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。

毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。

而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。

分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。

胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。

工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。

毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。

其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。

多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。

含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。

体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。

多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。

载体构建操作流程

载体构建操作流程载体构建操作流程一、载体准备1、质粒准备电泳检测载体质量好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环DNA和线性DNA。

超螺旋结构应至少占到90%。

测定质粒浓度用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。

2、质粒双酶切根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。

以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下：试剂体积质粒<1 μgEnzyme I 1μLEnzyme II 1μL10×X Buffer 2μL灭菌水to 20μL总体积20μL将上述体系置于37℃（不同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。

根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2 μl进行电泳检测。

3、回收质粒凝胶回收参照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书。

1)称量胶块重量，计算胶块体积。

计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计向胶块中加入胶块融化液Buffer GM，我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一般加入3个凝胶体积量。

2)均匀混合后室温15-25℃融化胶块。

此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约5～10分钟）。

3)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

将上述操作的溶液转移至Spin Column 中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。

滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。

4)将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。

5)重复操作步骤。

6)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm 离心1分钟。

7)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。

关于PEG-MAL包裹四氧化三铁150nm,纳米粒子包载药物的过程

关于PEG-MAL包裹四氧化三铁150nm，纳米粒子包载药物的过程今天小编整理并分享关于PEG-MAL包裹四氧化三铁150nm，纳米粒子包载药物的过程：PEG-MAL包裹四氧化三铁150nm英文名称为PEG-MAL coating Fe3O4 nanoparticles（150nm）。

理想情况下,载有药物的纳米颗粒进入生物体内后,应定向集中于目标区域,通过简单的自由扩散或酶催化以及生理环境的改变（如温度和 pH等)，将载带药物释放到病变部位。

这样的用药方式可以减少毒副作用、降低药物的用量、提高药物的效率，能够maximum的避免杀死正常细胞，被形象地称为“生物导弹”技术。

四氧化三铁纳米粒可以包载药物：将药物包载到四氧化三铁（Fe3O4）纳米粒子上通常涉及以下一般步骤：1. 准备四氧化三铁纳米粒子：首先，制备四氧化三铁（Fe3O4）纳米粒子，通常可以使用化学共沉淀法、溶胶凝胶法、热分解法等合成方法。

这些方法可以调控纳米粒子的形状、大小和分散性。

2. 表面修饰：纳米粒子通常需要进行表面修饰，以提高其生物相容性和稳定性。

常见的修饰方法包括硅化、氨基化、羧化等。

例如，可以使用氨基化来引入氨基官能团（-NH2），为药物的结合提供基础。

3. 药物包载：a. 物理吸附法：药物可以通过物理吸附的方式附着在纳米粒子的表面。

这种方法简单易行，但药物的稳定性可能较差。

b. 化学结合法：使用化学手段将药物共价结合到纳米粒子表面的官能团上。

例如，如果纳米粒子表面有氨基官能团，可以使用巯基（-SH）修饰的药物与之反应形成稳定的硫醚键。

c. 载体介入法：将药物包裹在具有药物释放功能的载体（如聚合物微球）内，再将这些载体与纳米粒子进行复合，实现药物的包载和释放。

4. 表征和稳定性测试：对药物包载后的纳米粒子进行表征，例如使用透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）等技术确认药物的包载，并进行稳定性测试，了解在不同条件下的稳定性和药物释放性能。

大肠杆菌_枯草杆菌穿梭质粒载体pSUGV4的构建_刘成君

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肠道细菌快速药敏试剂盒(比色法)药品说明书

肠道细菌快速药敏试剂盒(比色法)
药品名称：
通用名称：肠道细菌快速药敏试剂盒(比色法)
英文名称：RAPID ATB E4
成份：
RAPID ATBE4试条+干燥剂：氨苄西林、头孢吡肟、阿莫西林-克拉维酸、庆大霉素、替卡西林、妥布霉素、替卡西林-克拉维酸、奈替米星、哌拉西林、阿米卡星、哌拉西林+他唑巴坦、四环素、亚胺培南、氯霉素、头孢噻吩、复方新诺明、头孢唑啉、奈啶酸、头孢西丁、诺氟沙星、头孢孟多、氧氟沙星、头孢呋辛脂、环丙沙星、头孢呋辛、左氟沙星、头孢曲松、磷霉素、头孢他啶、呋喃妥英；
孵育盖；使用说明书。

产品有效期：2-8℃下避光保存，有效期12个月。

附件：
注册产品标准，产品说明书。

适应症：
该产品用于测定可导致腹泻、血流感染、尿路感染的肠道细菌在孵育4.5-5小时
后对抗生素的敏感性。

用法用量：
暂无
不良反应：
暂无。

禁忌：
暂无。

注意事项：
暂无。

贮藏：
暂无
有效期：
暂无
标准文号：
国食药监械(进)字2012第2402778号。