chip试剂盒17-371说明书翻译
QIAGEN Plasmid Kits(德国凯杰质粒提取试剂盒说明书中文翻译)
QIAGEN Plasmid Mini,Midi,and Maxi Kits（说明书中文翻译版）Plasmid Midi Kit(cat.Nos.12143and12145)The kit can be stored at room temperature(15~25℃)for up to2years.使用前的注意事项：（1）将Rnase A solution加入Buffer P1中，混匀，2~8℃储存。
（2）可选步骤：按1:1000的比例将LyseBlue试剂加入到Buffer P1中。
（3）使用前在4℃预冷Buffer P3，检查Buffer P2是否出现SDS沉淀。
（4）需准备好异丙醇和70%酒精。
（5）标志：圆形代表小提试剂盒；三角形代表中提试剂盒；正方形代表大提取试剂盒。
表1推荐LB培养物体积试剂盒高考倍质粒低拷贝质粒小提3mL不推荐中提25mL100mL大提100mL500mL具体操作步骤：1.收取过夜培养的细菌培养物，在4℃条件下6000×g离心15min。
2.（弃去上清液）使用4mL Buffer P1重悬菌体沉淀。
3.加入4mL Buffer P2，颠倒4~6次使彻底混匀，室温（15~25℃）孵育5min。
注：如果使用了LyseBlue试剂，溶液会变蓝。
4.加入4mL预冷过的Buffer P3，颠倒4~6次使彻底混匀，冰上孵育15min。
注：如果使用了LyseBlue试剂，溶液混匀后直至蓝色消失。
5.在4℃条件下≥20000×g（14000×g）离心30min。
6.平衡柱子QIAGEN-tip100：加入4mL Buffer QBT，通过重力流使液体过柱。
7.将第5步的上清液转移至QIAGEN-tip中，使其依靠重力流通过柱中的树脂。
8.使用10mL Buffer QC洗涤QIAGEN-tip，使Buffer QC依靠重力流通过柱中的树脂。
洗涤2次。
免疫共沉淀实验流程--chip
染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告步骤一：样品准备试剂和仪器：Biopulverizer(biospec)37% formaldehyde甘氨酸(Glycine)PBSprotease inhibitors步骤二：细胞交联1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。
2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。
3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。
4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。
5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。
800Xg，4°C离心5min，小心去掉上清。
步骤三：细胞裂解试剂:裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%;Tritonx -100 0.25%。
裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。
步骤:1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。
2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。
3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。
步骤四：超声破碎ＤＮＡ仪器:Bioruptor(Diagenode)步骤:(1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。
(2)、在超声池中注入一定量的冰水。
(完整word版)ChIP实验流程整理
1、ChIP实验用的苗是正常光照条件下生长的四周大的苗子，取1.5克嫩苗组织,放入50ml 1％甲醛溶液中,抽真空交联。
2、用2。
5ml 2M甘氨酸溶液停止交联反应。
3、水洗苗子数次，然后将苗用吸水纸吸干，液氮碾磨，然后用25ml提取缓冲液1重悬.extraction buffer I0。
4 M sucrose,10 mM Tris-HCl， pH 8，10 mM MgCl2,5mM b-mercaptoethanol，0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride [PMSF］,1＊ protease inhibitor； Roche)，4、用神奇滤器或者是金属筛过滤，然后4000rpm， 4℃离心20分钟5、用1ml提取缓冲液2,重悬沉淀物,14，000 rpm ,4℃离心10分钟。
extraction buffer II0.25 M sucrose,10 mM Tris—HCl， pH 8,10mMMgCl2，1％Triton X-100，5mM b—mercaptoethanol,0。
1mM PMSF,1＊protease inhibitor)6、用300ul提取缓冲液3,重悬沉淀物,14，000 rpm ，4℃离心60分钟.extraction bufferIII1。
7Msucrose,10mMTris-HCl， pH8,0.15%Triton X—100，2mMMgCl2,5mMb-mercaptoethanol，0.1mM PMSF,1＊protease inhibitor)7、粗核提取物用200ul裂解缓冲液重悬,在冰浴上孵育10分钟，以充分裂解细胞.8、超声处理，以剪切基因组DNA,使DNA大部分断裂成200-1000bp大小，如果能把大部分控制在400-800bp 则更佳。
超声过程中请一定注意要保持样品处于冰浴中，并且处于较低温度。
超声剪切的效果在后续去交联后可以用常规的DNA琼脂糖凝胶电泳检测。
CHIP实验步骤
CHIP-qPCR实验步骤一、实验材料●主要试剂●主要仪器及器材二、实验步骤1. 细胞交联：a. 用1ml PBS重悬细胞；b.加28ul 37%甲醛（终浓度为1%）进行交联，室温翻转孵育10min；c.加入10×甘氨酸至终浓度为1×；室温翻转孵育5min，终止交联；d.4℃，3000g，离心3min；弃上清液；e. 用1ml预冷的1X PBS重悬细胞，用3000g，4℃，5min离心，去上清。
f．重复e步骤一遍（此步骤沉淀可冻存于-80℃）；2. 胞核制备和染色质碎裂：a. 用200ul Membrane Extraction Buffer(使用前加入2ul蛋白酶/磷酸酶抑制剂)重悬细胞；冰上静置10min；b. 4℃，3000g，离心3min；弃上清液；c. 用200ul MNase Digestion Buffer （使用前加入0.2ul DTT）重悬细胞核;d. 加入0.2ul MNase ,吹打混匀；37℃水浴30min，期间5min混匀一次；e. 加入20μL MNase Stop Solution；混匀后冰上放置5min;f. 4℃，9000g，离心5min；弃上清液；g. 用100μL of 1X IP Dilution Buffer（使用前加入1ul蛋白酶/磷酸酶抑制剂）重悬沉淀；h. 冰上超声打断5次，每次2min。
i. 4℃,9000g离心5min;转移上清到新的EP管中3. 免疫沉淀：a. 取10ul上清作为input,-20℃冻存备用；b. 取90ul上清加入410ul X IP Dilution Buffer；阳性对照组加入10ul Anti-RNA Polymerase II Antibody，IP组加入10ug目的抗体；阴性对照组加入2μL IgG 。
c. 样本管放到翻转仪4℃翻转过夜孵育；d. 震荡混匀Protein A/G磁珠，并取20ul到每个实验组中；e. 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；f. 加入1ml IP Wash Buffer 1，并吹打混匀；置于翻转仪上，洗涤5min；g．将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；h. 重复步骤f~g 3次；i. 加入1ml IP Wash Buffer 2，并吹打混匀；置于翻转仪上，洗涤5min；j. 将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，弃上清；4. 洗脱：a.加入150ul 1X IP Elution Buffer重悬磁珠，37℃震荡孵育30min；b.将样品置于磁力架上，静置2min进行磁性分离，将上清转移到一个新的EP管中；c. input样本中加入150ul 1X IP Elution Buffer；d.各样本中分别加入6μL NaCl(5M) 、2μL 蛋白酶K(20mg/Ml);e. 65℃孵育2h;f. 使用DNA 纯化离心柱从样品中纯化DNA。
CHIP说明书
A细胞交联与溶解实验前准备1；处理过的细胞，80-90%150mm培养皿，内含20ml培养液1-2 x 107 cells可以分成十份，即每份1-2x1062；预冰1XPBS ml（step3）,培养皿预冰（step6）3；准备42 mL 1X PBS (4.2 mL 10X PBS and 37.8 mL water) for each 150 mm 培养皿并放于冰上。
用于洗涤。
4；SDS Lysis Buffer 于室温，使有助于细胞溶解5；Protease Inhibitor Cocktail II于室温下，step3和13会用到。
使用完后需放回-20℃。
1；加550ul的37%甲醛到20ml培养液里交联，轻轻漩涡混匀。
2；室温孵育10min3；同时，每个培养皿准备2ml PBS于管子里放在冰上,每1mlPBS加5ulProtease Inhibitor Cocktail II4；每个培养皿加2ml的10xGlycine，终止交联5；混匀，室温下孵育5min6；培养皿放于冰上7；尽量吸进培养皿中的液体，注意不要损伤到细胞8；加20ml冰的PBS洗涤细胞9；吸去PBS，再重复用PBS洗涤一次，吸去PBS。
10；加2ml步骤3准备的PBS11；用细胞刮棒将瓶底的细胞刮下，收集到1.5ml的离心管中12；700 X g于4℃离心2-5min，以沉淀细胞13；离心期间，准备溶解液——每1mlSDS Lysis Buffer内添加有5ulProtease Inhibitor Cocktail II●For every 1 x 107 HeLa cells, 1 mL of SDS Lysis Buffer isrecommended.不同细胞具体分析。
14；去上清（此步的细胞可以保存在-80℃）15；加入 1 mL 步骤13准备的溶解液，重悬细胞。
16；分装到离心管里，每个管300-400ul（这步的溶解产物可以冻存于-80℃）17；若超声条件优化好了，则接下来做超声裂解，反之，按照附录优化。
Chromatin Immunoprecipitation Kit
EZ ChIP™ KIT COMPONENTSA．提供的试剂盒成分（注意储存温度）保存于4℃：蛋白G琼脂糖/鲑鱼精DNA，Catalog#16-201c. 每瓶含1.5ml有600μg声波处理的鲑鱼精DNA,1.5mgBSA和约4.5mg重组蛋白G的密封微球. 以50%凝胶浆形式提供，每瓶终体积3ml.悬浮于TE buffer中，pH 8.0，含0.05%叠氮化钠.液体悬浮液.ChIP稀释缓冲液，Catalog # 20-153. 每瓶含24ml 0.01%SDS，1.1% TritonX-100, 1.2mM EDTA, 16.7mM Tris-HCl, pH 8.1,167mM NaCl.低盐免疫复合物漂洗缓冲液，Catalog # 20-154. 每瓶含24ml 0.1%SDS，1%Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 150mM NaCl.高盐免疫复合物漂洗缓冲液，Catalog # 20-155. 每瓶含24ml 0.1%SDS，1%Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris-HCl, pH 8.1, 500mM NaCl.LiCl免疫复合物漂洗缓冲液，Catalog# 20-156. 每瓶包含24ml 0.25M LiCl, 1% IGEPAL-CA630, 1% 脱氧胆酸(钠盐), 1mM EDTA, 10mM Tris, pH 8.1.TE Buffer, Catalog # 20-157. 两瓶,每瓶含24ml 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0.0.5M EDTA, Catalog # 20-158.每瓶含250μl 0.5M EDTA, pH 8.0.5M NaCl, Catalog # 20-159. 每瓶含500μl 5M NaCl.SDS裂解液, Catalog # 20-163. 每瓶含10ml 1% SDS, 10mM EDTA, 50mM Tris, pH 8.1.1M Tris-HCl, pH 6.5, Catalog # 20-160. 每瓶含500μl 1M Tris-HCl, pH 6.5.10X 甘氨酸, Catalog # 20-282. 每瓶含11ml 1.25M Glycine.10X PBS, Catalog # 20-281. 每瓶含24ml 10X PBS.保存于-20℃：蛋白酶抑制剂混合物Ⅱ，Catalog # 20-283. 两瓶，每瓶含110μl 200X 蛋白酶抑制剂混合物Ⅱ于DMSO中.RNase A, Catalog # 20-297. 每瓶含600μg RNase A于60μl无菌水中.蛋白酶K，Catalog # 20-298. 每瓶含600μg 蛋白酶K于60μl 50mM Tris-HCl中, pH 8.0, 10mM CaCl2.1M NaHCO3, Catalog # 20-296. 每瓶含600μl 1M NaHCO3.10X PCR Buffer, Catalog # 20-295. 每瓶含200μl 750mM Tris-HCl, pH 8.8, 200mM(NH4)2SO4, 0.1% Tween○R-20, 25mM MgCl2.参照引物, Catalog # 22-004. 每瓶含75μl5μM的人类GAPDH基因特异性引物.FOR: 5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’REV: 5'-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3'反义RNA 聚合酶II, clone CTD4H8, Catalog # 05-623B. 每瓶含25μg反义RNA 聚合酶II, clone CTD448.Normal Mouse IgG, Catalog # 12-371B. 每瓶含25μg normal mouse IgG.室温存放：20% SDS, Catalog # 20-280. 每瓶含242μl 20% SDS.离心过滤柱，Catalog # 20-290. 每袋有22个装在收集管中的离心过滤柱.收集管，Catalog # 20-291. 每袋22个收集管.结合剂A，Catalog # 20-292. 每瓶含25ml 结合剂A.漂洗剂B，Catalog # 20-293. 每瓶含12.5ml 洗涤试剂B洗脱剂C，Catalog # 20-294. 每瓶含1.5ml 洗脱剂C.B. 不提供的材料试剂●实验所需刺激或处理过的细胞●染色质免疫沉淀所需抗体●37%甲醛●Taq DNA 聚合酶●dNTPs, 每个2.5mM●无DNase 和RNase的无菌水设备●漩涡振荡器●转轮/转台？●计时器●不同体积的枪和枪头●离心机●可变温水浴●细胞刮棒●超声波发生器● 1.5ml离心管●实施定量仪●0.2ml PCR管●过滤嘴枪头IV. CHROMATIN IMMUNOPRECIPITATION PROTOCOL A．体内交联与裂解开始这部分之前：●如需要，刺激或处理哺乳动物粘附细胞在含10ml培养基的100mm培养皿中贴壁生长汇合至80-90%的状态.对HeLa细胞来说，约为2 x 107 个细胞.这可产生可用于10次独立的免疫共沉淀的染色质.包括一个额外的仅用于估计细胞数目的培养皿.●取冰用于PBS保温（见步骤3）和培养皿的保温（见步骤6）●每个培养皿准备21ml 1×PBS（2.1ml10×PBS+18.9ml H2O)，置于冰上.用于漂洗并需保持冰冷.●SDS裂解缓冲液热至室温以保证SDS在继续裂解细胞之前处于溶解状态.●移开蛋白酶抑制剂混合物Ⅱ并于室温下融化，用于步骤3和13. 此物含DMSO，在18.4℃以下为凝结状态.1． 10ml培养基中加入270ul 37%甲醛（或540ul新配制的18.5%甲醛）用于交联，温和地转动培养皿使其混合.●终浓度为1%.●使用高质量的甲醛.如果甲醛过期请勿使用.每次使用前配制新鲜甲醛，见附录B.2．室温下孵育10min.●不需搅动细胞.3．同时，吸取1ml冷的1×PBS至单独的管中，加入5ul蛋白酶抑制剂混合物Ⅱ(每个皿1m l ×1PBS).4．每个皿加入1ml 10×Glycine以抑制未反应的甲醛.5．转动混匀，室温孵育5min.6．将培养皿置于冰上.7．吸取培养基，尽可能将培养基除去，注意不要搅动细胞.8．加入10ml冷的1×PBS漂洗细胞.9．除去PBS，重复PBS漂洗，步骤8,9.10．往培养皿中加入10ml含1×蛋白酶抑制剂混合物Ⅱ的1×PBS（步骤3中配制）.11．将每个培养皿中的细胞刮下置于离心管中.12．4℃下700 x g（这个转速要怎么算？？依据离心力？？G=mrw2=700 x g？？已经混乱了...）离心2-5min使细胞成颗粒状? （这翻译真纠结…..）13．离心的同时，将5ul 蛋白酶抑制剂混合物Ⅱ加入每份1ml SDS裂解缓冲液.本实验方案推荐每2 x 107个HeLa细胞使用1ml SDS裂解缓冲液.依据不同细胞浓度调整，裂解液与细胞密度的比例对细胞完全裂解是很重要的.14．除去上清.（细胞可在这一步冻存于-80℃.）15．在含1×蛋白酶抑制剂混合物Ⅱ的1ml SDS裂解缓冲液中，重悬细胞.16．每个离心管分装300-400ul.（裂解产物可冻存于-80℃.）17．如果已确定声波降解的最优条件，继续Section B.若没有，参阅附录A.。
外部标准试剂盒（λ polyA）说明书
Code No. 3789 研究用External Standard Kit(λ polyA) for qPCR说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容 1 ●保存 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●操作方法 1 ●实验例 2 ●参考文献 3 ●关联产品 3●制品说明在基因表达分析中，内参基因常常被用来校正目的基因的表达量。
目的基因表达水平由内参基因来校正的方法即相对定量。
管家基因常被作为内参基因来使用，但在某些实验中也很难确定稳定表达的基因。
这种情况下，添加外源的标准RNA到反应液中作为参照，对于相对定量的准确性比较有效。
本试剂盒提供了Real Time RT-PCR实验用的外部参照，包含了对照RNA（λpolyA+ RNA-A）、稀释液（EASY Dilution）和用于检测的引物（Real Time Primer for λpolyA）。
对照RNA是以λ DNA片段作为模板体外转录获得约1.0 kb的polyA+ RNA，此RNA用于Real Time RT-PCR实验中研究真核生物基因表达的外部参照。
另外，由于λpolyA+RNA-A在3’末端有polyA序列，也可以使用oligo dT引物进行反转录反应。
●制品内容Real Time Primer for λpolyA 10 μM each 200 μlEASY Dilution (for Real Time PCR)* 1 mlλpolyA+ RNA-A 10 ng/μl 15 μl* EASY Dilution (for Real Time PCR)（Code No. 9160）可以单独购买。
●保存：Real Time Primer for λpolyA和EASY Dilution (for Real Time PCR)：-20℃λpolyA+ RNA-A：-80℃●试剂盒外必备材料：∙反转录和Real Time PCR反应试剂，如：PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time) (Code No. RR036A/B)TB Green®Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820A/B)One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (Code No. RR096A/B) ∙ 0.2 ml和1.5 ml microtubes∙微量移液器和枪头∙ Thermal cycler∙ Real Time PCR仪●操作方法：1.稀释λpolyA+ RNA-A使用EASY Dilution (for Real Time PCR)对10 ng/μl λpolyA+ RNA-A（约1.8×1010 copies/μl）制备适合Real Time PCR实验的连续梯度稀释液（详见下面的“实验例”）。
CHIP染色质免疫共沉淀实验 Protocol
CHIP染色质免疫共沉淀实验是一种在全基因组水平上研究蛋白质与DNA相互作用的技术方法。
其实验原理是基于抗原抗体反应的特异性，从而实现对DNA结合蛋白及其DNA靶标的富集。
实验所需试剂和耗材包括：细胞培养及提取试剂、生物素标记试剂盒、抗体、蛋白质A琼脂糖珠、Triton X-100、ECL显影液等。
实验仪器包括：二氧化碳培养箱、倒置显微镜、离心机、染色质免疫沉淀仪等。
实验准备工作的要点包括：首先，要确认所用试剂和耗材的型号和保质期；其次，要确保细胞株和抗体的选择合适；最后，准备好实验所需的仪器设备并调试至最佳状态。
实验方法主要包括以下步骤：1.将细胞进行培养并提取染色质。
2.在染色质中加入对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，并用Triton X-100将抗原抗体混合物进行稀释。
3.在混合物中加入蛋白质A琼脂糖珠，以便吸附多余的抗体和未结合的蛋白质。
4.用洗涤液洗涤沉淀物，去除未结合的蛋白质和抗体，最后用变性液洗脱DNA。
5.用电泳法和显影法检测提取出的DNA片段。
注意事项包括：要保持细胞生长状态良好，并确保抗原抗体反应的时间和温度准确适宜；在加入蛋白质A琼脂糖珠后，要充分混匀以避免影响实验结果；最后，要注意控制好电泳参数和显影条件以保证结果的准确性和可靠性。
常见问题及解决方法包括：如果抗原抗体反应不充分，可以尝试增加抗体浓度或延长反应时间；如果未结合的蛋白质不能被有效清除，可以尝试增加洗涤次数或更换洗涤液；如果电泳条带不清晰或出现异常，可以尝试调整电泳参数或更换电泳液。
总之，CHIP染色质免疫共沉淀实验是一种研究蛋白质与DNA相互作用的有效方法，需要注意保持细胞生长状态良好、准确控制抗原抗体反应条件、充分洗涤未结合的蛋白质等关键点。
同时，针对实验中可能遇到的问题，要积极采取相应的解决方法，以保证实验结果的准确性和可靠性。
热点实验：CHIP染色质免疫共沉淀实验案例介绍
背景：真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。
与传统的EMSA技术相比，染色质免疫沉淀技术（CHIP）能真实完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。
原理：是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质－DNA复合物，超声将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后加入目的蛋白抗体，通过抗体沉淀靶蛋白-DNA复合物，通过洗脱的方法得到富集的靶蛋白-DNA复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测（PCR分析），从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
应用：1.组蛋白修饰研究 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 5.DNA损伤与凋亡分析。
步骤：1）甲醛处理细胞2）收集细胞，超声破碎3）加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合4）加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，沉淀5）对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合6）洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物7）解交联，纯化富集的DNA-片断8）PCR或基因芯片分析。
实验案例证明C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的结合实验背景：在IL－6诱导条件下,利用CHiP技术提取C/EBP－DNA复合物，以Tmub1基因的碱基序列设计引物，以提取的DNA为底物，进行扩增，从而证明C/EBP结合的DNA含有Tmub1基因，进一步确认C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的相互作用。
实验分组：分2个组进行实验普通PCR检测和WB检测（检测Tmub1蛋白表达水平，抗体嘉美生物实验室提供。
注：嘉美生物实验室提供绝大多数常用国外原装进口抗体，为实验委托者节约大量实验经费。
）第一组：A组第二组：B组转染3天后收集细胞做CHIP-PCR以及WB检测实验对照：设定的对照有1、阳性对照（系统阳性对照，Anti-RNA Polymerase II）2、INPUT对照（DNA片段在沉淀以前，收集下来的对照）3、阴性对照（非免疫IgG血清吸附，Normal Mouse IgG）细胞转染流程:略EZ-ChIP™染色质免疫共沉淀实验检测流程（Upstste Catalog # 17-371)1、Kit Description：试剂盒内含的RNA聚合酶II阳性对照抗体2、试剂盒组分：A. Provided Kit ComponentsStore at 4℃:ChIP Blocked Protein G Agarose 1.5 mlChIP Dilution Buffer, One vial containing 24 mlLow Salt Immune Complex Wash Buffer 24 mlHigh Salt Immune Complex Wash Buffer 24 mlLiCl Immune Complex Wash Buffer 24 mlTE Buffer 24 ml0.5 M EDTA 250 ul5 M NaCl 500 ulSDS Lysis Buffer 10 ml1 M Tris-HCl, pH 6.5 500 ul10X Glycine 11 ml10X PBS 24 mlStore at -20℃:Protease Inhibitor Cocktail II（蛋白酶抑制剂） 2×110 ulRNase A 600 ug of RNase A in 60 ulsterile water.Proteinase K 600 ug of Proteinase K in 60 ul 1M NaHCO3 600 ulAnti-RNA Polymerase II 25ug clone CTD4H8.Normal rat IgGStore at Room Temperature:20% SDS 242 ul of 20% SDS.Spin Filters One bag containing 22 Spin Filters with Collection TubesCollection Tubes 22 Collection Tubes.Bind Reagent A 25 ml of Bind Reagent A.Wash Reagent B 12.5 ml of Wash Reagent B.Elution Reagent C 1.5 ml of Elution Reagent C.B. 抗体及血清特异性抗体：Anti-CEBP Beta antibody [E299] (ab32358,嘉美生物提供)Normal rat IgGC. 仪器设备微量混匀器Vortex mixer,震摇器Rotating wheel/platform.计时器Timer,可调微量加样枪以及tip头，Variable volume (5-1000 ml) pipettes + tips高速离心机Microfuge,Variable temperature water bath,细胞刮子Cell scraper,Sonicator,1.5 Ml离心管Microfuge tubes,PCR管PCR tubes,D. 引物设计略4、CHIP 操作流程A. 细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解预先准备：1) 准备细胞，150 mm培养瓶（20ml培养液）密度为80-90%，细胞数量≥1 x 10-7个；2) 准备42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PBS +37.8 ml water),放入150 mm培养皿以冰块预冷；3) 取出SDS Lysis Buffer，放置至常温确保SDS溶解不析出；4) Protease Inhibitor Cocktail II恢复至室温。
植物染色质免疫沉淀分析(CHIP)试剂盒
植物染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒产品说明书主要用途植物染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂是一种旨在通过甲醛交联、物理或化学处理细胞核以及染色质，从而运用特异抗体结合免疫沉淀，然后萃取DNA，扩增分析，来确定结合蛋白的目标DNA序列的权威而经典的技术方法。
该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。
其适用于DNA复制、重组、修复、转录、病毒组装中的DNA和蛋白质（包括转录因子、聚合酶、组蛋白等）的相互作用的研究。
广泛应用于定性检测各种植物组织（花瓣、叶片、种子等）DNA蛋白结合序列和定量检测序列特异性DNA结合蛋白（例如转录因子）及其突变形成等。
产品即到即用，性能稳定，操作便捷，反应敏感，结合显著，重复性好。
技术背景DNA和蛋白质的相互作用是调控细胞反应过程的要素之一。
染色质免疫沉淀分析方法（chromatin immunoprecipitation；CHIP）是研究活体内（in vivo）DNA和蛋白质的相互作用的最新最有力的工具：用于分析染色质结构动力学、转录因子调节、以及表观遗传学变异等。
CHIP技术通过三大步骤实现：第一，甲醛固定后染色质分离和断片；第二，运用特异蛋白之抗体，免疫共沉淀结合蛋白（包括转录因子、聚合酶、组蛋白等）的染色质片断；第三，分析目标DNA和蛋白的修饰。
其中转录因子作为调节蛋白，通过结合核DNA，以达到控制基因表达。
产品内容清理液（Reagent A）毫升固着液（Reagent B）毫升终止液（Reagent C）毫升裂解液A（Reagent D）毫升裂解液B（Reagent E）毫升裂解液C（Reagent F）毫升核溶液（Reagent G）毫升稀释液（Reagent H）毫升结合液（Reagent I）毫升低盐液（Reagent J）毫升高盐液（Reagent K）毫升平衡液（Reagent L）毫升缓冲液（Reagent M）毫升洗脱液（Reagent N）毫升解联液（Reagent O）毫升酶解液（Reagent P）微升萃取液（Reagent Q）毫升浓缩液（Reagent R）毫升沉淀液（Reagent S）毫升净化液（Reagent T）毫升扩增液（Reagent U）微升补充液（Reagent V）毫升说明书1份保存方式保存裂解液A（Reagent D）、裂解液B（Reagent E）、裂解液C（Reagent F）、核溶液（Reagent G）、稀释液（Reagent H）、结合液（Reagent I）、解联液（Reagent O）、酶解液（Reagent P）、萃取液（Reagent Q）、浓缩液（Reagent R）和扩增液（Reagent U）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月用户自备特异抗体：用于目标蛋白的结合特异引物：用于目标DNA的扩增或测序1.5毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器2毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器50毫升锥形离心管：用于植物组织处理的容器恒温水槽：用于孵育反应物震荡器：用于混匀反应物4℃微型台式离心机：用于沉淀样品4℃台式离心机：用于沉淀样品平式摇荡仪或摇床：用于孵育和混匀反应DOUNCE匀浆器：用于裂解植物组织细胞超声仪：用于裂解植物组织细胞核PCR仪：用于扩增反应电泳仪：用于检测扩增产物实验步骤实验开始前，准备好待测植物的预处理：药物处理等。
chipprotocol中文
chipprotocol中文CHIPPROTOCOL（基于milliporeEZ-CHIPcatalog#17-371）：实验原理：在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
实验步骤：第一天：【实验材料准备】：1000ul、100ul、200ul、20ul移液器，大、中、小号tip，1.5mlEP 管，200ulPCR管。
【实验仪器准备】：台式低温离心机，超声仪，电泳设备一套，旋转混匀仪，层析柜。
【实验试剂准备】：SDSlyibuffer复温，使其充分溶解，避免沉淀；proteaeinhibitorcocktail室温下充分解冻；PBS预冷（若使用试剂盒提供10某PBS，使用前还需用去离子水稀释成1某PBS工作液）。
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎某。
1、收集细胞（1-2某10^7），加入37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（0.7%）。
2、室温孵育10min（精确计时）。
3、及时终止交联：加10某甘氨酸终浓度为1某。
混匀后，在室温下放置5min。
4、沉淀细胞（700g4℃2-5min），用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、弃上清（细胞沉淀可以暂时冻存于-80℃备用）。
6.准备裂解液（1mlSDSlyibuffer+5ulproteaeinhibitorcocktail）；按照细胞量（1某10^7hela细胞对应1mlSDSlyibuffer）加入SDSLyiBuffer，重悬细胞。
分装成300-400ul1管（裂解产物可以-80℃冻存备用）。
7、超声破碎（根据具体情况调整）：普通超声仪：3档冲击15冰上放置45共5次Bioruptor超声神器：中档冲击15停顿45≧14次（更均一更集中）8、琼脂糖凝胶电泳鉴定：取1某10^5个细胞，加入CHIPdilutionbuffer至终体积50ul，进行解交联后电泳Option1—a.加入RNaeA（10mg/ml）1ul，37℃孵育30分钟。
ChIP-seq阴阳-正负对照
ChIP-seq阴阳-正负对照关于对照说到实验设计就不得不提到对照。
从小老师教育我们，没有对照组的实验是不完整的，或者说就没有任何意义。
所有的生化湿实验都很讲究完整的正对照和负对照。
当然，下面的实验我都没做过。
蛋白相关实验真真假假的事情太多。
要把蛋白和已知相关的蛋白放在一起, 和已知不相关的放在一起, 检验实验手段是否能够区分这两种情况。
所谓的正负对照，就是告诉别人我这个实验本身做的没问题。
如果再往下做还要通过移除一个蛋白, 来看另一个蛋白的生理表现，看是不是'没有对方就活不下去'，是不是可能有其他的couple。
比如GST pull down 实验，如果要证明A蛋白和B蛋白相互作用，做SDS-PAGE要有一个纯粹的B蛋白溶液(input)作为阳性对照，必须看到条带说明B蛋白是真实存在的而且可以显色；还需要一个纯粹的GST蛋白作为阴性对照，必须看到纯粹的GST蛋白是无法拉下B 蛋白的。
真正的实验里面是融合GST标签的A蛋白去拉B蛋白，如果有条带，说明A，B蛋白的确有相互作用。
ChIP 中的对照ChIP实验，ChIP实验的对照可以说是挺麻烦的一件事情。
首先是input 对照，Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率。
然后是阳性对照需要使用阳性抗体，一般用anti-RNA Polymerase II抗体，因为RNA Polymerase II是通用转录因子，在所有细胞中都能结合基因（为了保证阳性对照有效，一般选择阳性对照的引物是根据管家基因设计的）的核心启动子区，因此，理论上ChIP后PCR都会有条带。
最后阴性对照需要用阴性抗体，用普通的IgG做为抗体，理论上不会ChIP下来任何DNA片段，但是由于非特异结合，或者实验过程中没发生结合的DNA清除不完全，可能也会出现比较浅的条带。
注意，上述所谓的阴性阳性对照都是针对具体的一次ChIP PCR 实验而言的，只能说明这个实验做的有没有物理上的问题。
chip试剂盒17-371说明书翻译
CHIP步骤实验前准备：·处理细胞，将细胞保持在装有20ml培养基的150mm培养皿中。
·冰预冷PBS（第3步）、培养皿（第六步）。
·每个150mm培养皿准备42ml1*PBS(10*PBS 4.2ml+水37.8ml),冰上预冷。
·预热SDS到室温，确保在细胞裂解之前彻底溶解。
·将protease inhibitor cocktail II放置室温待用。
A体内交联和溶解1、加550 μl 37%的甲醛（或1.15ml新鲜的18.5%甲醛）到20 ml 细胞培养基中进行交联反应，轻轻地晃动混匀。
·甲醛的终浓度为1%。
尽量使用新鲜的甲醛（配置方法见附录B）。
2、室温下孵育10 min。
·不要振荡细胞。
3、取2 ml冰冷的1*PBS于分离管中至于冰上（每个培养皿对应一个），每1ml PBS中加5 ul Protease Inhibitor Cocktail II。
4、加2 ml 10×Glycine到培养皿中将未反应的甲醛消除。
5、晃动混匀并在室温下孵育5 min。
6、将培养皿放在冰上。
7、吸出培养基，尽可能的将培养基去除干净，小心不要扰乱细胞。
8、加20 ml冰冷的1*PBS来洗涤细胞。
9、除去PBS，再用PBS洗涤一次。
10、加2 ml含1×Protease Inhibitor Cocktail II的冷PBS到培养皿中(从第3步得)。
11、将细胞从培养皿刮下来放到离心管中。
12、4℃，700 g（900~1000 rpm）离心2~5 min沉淀细胞。
13、准备好1 ml(1*107个细胞推荐1ml) SDS Lysis Buffer（含5ul Protease Inhibitor Cocktail II）。
14、除去上清液（此步中的细胞沉淀可以放在-80℃中保存）。
15、用准备好的1 ml SDS Lysis Buffer(含1* Protease Inhibitor Cocktail II）重悬细胞。
染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南及技术总结
染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）彼此结合的实验技术。
由于ChIP采用甲醛固定活细胞或组织的方式，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。
这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白彼此结合的实验方式所不能比拟的。
当用甲醛处置时，彼此靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA 或RNA）之间会产生共价键。
细胞内，当TF与Promoter彼此结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或契合在一路，这个时候用甲醛处置，能使它们之间产生共价键。
一般ChIP的流程是：甲醛处置细胞——搜集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物彼此结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，取得富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。
在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。
可是此刻随着荧光定量PCR的普及，大家也愈来愈偏向于Q－PCR了。
另外还有一些由ChIP衍生出来的方式。
例如RIP （其实就是用ChIP的方式研究细胞内蛋白与RNA的彼此结合，具体方式和ChIP差不多，只是实验进程中要注意避免RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集取得的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要按照公司的要求来准备样品）。
第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
一、掏出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。
（培育基共有9ml）二、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。
二甲双胍抑制 SREBP-1c 改善高脂诱导的骨骼肌胰岛素抵抗
二甲双胍抑制 SREBP-1c 改善高脂诱导的骨骼肌胰岛素抵抗吴文君;汤孙寅炎;时俊锋;尹雯雯;曹殊;朱大龙;毕艳【摘要】目的：二甲双胍已成为治疗2型糖尿病的一线药物,前期研究结果提示固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regula-tory element binding protein-1c,SREBP-1c)抑制胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)基因转录表达,在高脂诱导骨骼肌胰岛素抵抗中起关键作用。
该研究探讨SREBP-1c 在二甲双胍改善高脂诱导骨骼肌胰岛素抵抗中的作用及机制。
方法经500μmol·L -1 PA 处理的 L6细胞被二甲双胍(1、10 mmol·L -1)干预24 h 后,采用2-NBDG方法检测其葡萄糖摄取水平,Western blot 检测 SREBP-1c、FAS、p-IRS-1( Tyr608/612)、IRS-1、p-AKT( Ser473)、AKT 的蛋白表达。
双荧光素酶报告基因实验检测二甲双胍对SREBP-1c 和 IRS-1基因转录的调控。
CHIP 定量分析二甲双胍处理后 SREPB-1c 蛋白与 IRS-1启动子区域的相互作用。
结果 L6肌管细胞经 PA 处理后,糖摄取下降,SREBP-1c 及其下游分子 FAS 表达升高,胰岛素信号通路相关分子 p-IRS-1(Tyr608/612)、IRS-1、p-AKT(Ser473)/ AKT 表达下降；不同浓度二甲双胍干预后,L6肌管细胞糖摄取呈剂量依赖性增加,SREBP-1c、FAS 表达下降,而 p-IRS-1(Tyr608/612)、IRS-1、p-AKT(Ser473)/ AKT 表达升高。
双荧光素酶报告基因实验结果显示二甲双胍抑制 SREBP-1c 启动子活性,增加 IRS-1启动子活性。
CHIP 结果显示二甲双胍使 SREBP-1c 蛋白结合到 IRS-1启动子区域的量下降约30%。
胃泌素17(G-17)测定试剂盒(荧光免疫层析法)产品技术要求北京华科泰生物技术
胃泌素17（G-17）测定试剂盒（荧光免疫层析法）适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人血清、血浆或全血中胃泌素17（G-17）的含量。
1.1 规格10人份/盒、20人份/盒、50人份/盒。
1.2 主要组成成分表1 主要组成成分注：质控品质控范围批特异，具体浓度详见靶值单。
2.1 物理性能2.1.1 外观检测卡应整洁完整、无毛刺、无破损、无污染；材料附着牢固。
2.1.2 膜条宽度膜条的宽度应不小于3mm。
2.1.3 移行速度液体移行速度应不低于10mm/min。
2.1.4 样本稳定剂装量样本稳定剂装量应不小于标示量。
2.1.5 样本稳定剂pH值样本稳定剂pH值应在7.1～7.6范围内。
2.2 溯源性根据GB/T 21415-2008的有关规定，提供所用校准品的来源、赋值过程及测量不确定度等内容，溯源至企业工作校准品，并与已上市产品比对赋值。
2.3 空白限空白限应不高于1pg/mL。
2.4 准确度回收率应在85%～115%之间。
2.5 线性在线性范围［2，100］pg/mL内，相关系数（r）应不低于0.99。
2.6 重复性分别检测高值和低值两个样本，重复性（CV%）应不高于15.0%。
2.7 批间差在三个批次产品之间，样本测定结果的变异系数（CV%）应不高于20.0%。
2.8 特异性表2 与PGⅠ、PGⅡ的交叉反应2.9 质控品赋值有效性测定高值、低值浓度质控品，其结果均应在质控范围内。
2.10 稳定性2.10.1效期稳定性10℃～30℃储存（质控品2℃～8℃），有效期12个月，效期后分别检测2.3～2.6，2.8，2.9项，其结果应符合各项规定。
2.10.2 质控品复溶稳定性质控品开瓶复溶后2℃～8℃储存，有效期1个月，分别检测2.6，2.9项，其结果应符合各项要求。
（完整版）CO-IP说明书
（完整版）CO-IP说明书说明书（CO-IP26149）Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒 261492181.6 描述26149 Pierce 免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒，包含⾜够进⾏ 50 次免疫沉淀反应的试剂（每次使⽤ 25ul 树脂固相化抗体）试剂盒组分：加强型AminoLink偶联树脂，2 mL 固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100ul 50%的浆液含有50ul固相树脂）20×交联缓冲液，25mL，使⽤时稀释⾄：0.01M Na ，0.15MNaCl；pH 7.2氰基硼氢化钠溶液（5 M），0.5 mL淬灭缓冲液，50 mL ，1M Tris-HCl洗涤缓冲液，60 mL，1M NaClIP 裂解/洗涤缓冲液，2 50mL，0.025MTris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1% NP-40，5%⽢油；pH 7.4改良型杜⽒PBS （20×），25mL，使⽤时稀释⾄：0.008M Na 、0.14MNaCl、0.01M KCl；pH7100×条件缓冲液，5mL，中性pH 缓冲液洗脱缓冲液，50 mL，pH 2.8，含有伯胺⾮还原型泳道标记上样缓冲液，（5×），5 mL，0.3M Tris?HCl，5% SDS，50%⽢油，泳道标记⽰踪染料；pH 6.8Pierce 离⼼柱-带螺帽，100 个柱⼦，包含相应配件微量离⼼收集管，2 mL，100个微量离⼼样品管，1.5mL，50个Pierce对照⽤琼脂糖树脂（4％琼脂糖珠交联），2 mL 固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100ul50%的浆液含有50ul的固相树脂）⼲燥保存。
常温运输。
产品简介 Thermo Scientific Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒通过将纯化的抗体直接固定在琼脂糖基质上，从细胞裂解液或其它复杂混合物中分离天然蛋⽩复合体。
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CHIP步骤实验前准备：·处理细胞，将细胞保持在装有20ml培养基的150mm培养皿中。
·冰预冷PBS（第3步）、培养皿（第六步）。
·每个150mm培养皿准备42ml1*PBS(10*PBS 4.2ml+水37.8ml),冰上预冷。
·预热SDS到室温，确保在细胞裂解之前彻底溶解。
·将protease inhibitor cocktail II放置室温待用。
A体内交联和溶解1、加550 μl 37%的甲醛（或1.15ml新鲜的18.5%甲醛）到20 ml 细胞培养基中进行交联反应，轻轻地晃动混匀。
·甲醛的终浓度为1%。
尽量使用新鲜的甲醛（配置方法见附录B）。
2、室温下孵育10 min。
·不要振荡细胞。
3、取2 ml冰冷的1*PBS于分离管中至于冰上（每个培养皿对应一个），每1ml PBS中加5 ul Protease Inhibitor Cocktail II。
4、加2 ml 10×Glycine到培养皿中将未反应的甲醛消除。
5、晃动混匀并在室温下孵育5 min。
6、将培养皿放在冰上。
7、吸出培养基，尽可能的将培养基去除干净，小心不要扰乱细胞。
8、加20 ml冰冷的1*PBS来洗涤细胞。
9、除去PBS，再用PBS洗涤一次。
10、加2 ml含1×Protease Inhibitor Cocktail II的冷PBS到培养皿中(从第3步得)。
11、将细胞从培养皿刮下来放到离心管中。
12、4℃，700 g（900~1000 rpm）离心2~5 min沉淀细胞。
13、准备好1 ml(1*107个细胞推荐1ml) SDS Lysis Buffer（含5ul Protease Inhibitor Cocktail II）。
14、除去上清液（此步中的细胞沉淀可以放在-80℃中保存）。
15、用准备好的1 ml SDS Lysis Buffer(含1* Protease Inhibitor Cocktail II）重悬细胞。
16.能整除300~400ul的微型管。
（溶解产物可放在-80储存）17如果超声条件理想直接进行B部分，否则查看附录A。
B 超声断裂DNA实验前准备：·选择最佳的超声条件来打断交联的DNA，使其长度为200~1000 bp（查看附录A）。
1、需要的话，从步骤A-16中取5 μl细胞裂解液进行电泳检测未打断的DNA。
2、在冰上超声处理细胞裂解液。
（条件摸索）3、4℃10000~15000 g（~12000 rpm）离心10 min除去不溶解的沉淀。
4、有需要的话，可以取出5ul打断的DNA电泳检测超声效果。
5、将上清液吸到一个新的离心管中，100ul一份。
·每100μl包含106个细胞的裂解产物，可以用来做一次免疫沉淀反应。
·打断的交联染色质可以在-80℃中保存2个月。
C、Immunoprecipitation (IP) of Crosslinked Protein/DNA实验前准备：·取出Protease Inhibitor Cocktail II在室温融化（步骤3用）。
1、准备足够的Dilution Buffer（含protease inhibitors），放在冰上。
·每个IP实验需要900ul Dilution Buffer和405 ul Protease Inhibitor Cocktail II。
·测试样品包括：阳性对照Anti-RNA Polymerase II，阴性对照Normal Mouse IgG，和自己实验用的抗体。
建议增加一个与自己所用抗体同源的阴性对照IgG。
2、准备一个微型离心管包含100ul打断的交联好的染色质(B-5)放在冰上。
·若用同一样品进行多个免疫沉淀反应，可将1.1 ml样品放在一管中进行实验。
·每100ul包含1*106细胞来做免疫沉淀。
3、加900ulDilution Buffer（含Protease Inhibitor Cocktail II）到100ul 染色质样品中。
4、每一个IP加60ul Protiein G Agarose。
·Protiein G Agarose 是一个50%混悬液，吸取前轻轻的颠倒混匀。
5、4℃旋转孵育1 h。
6、瞬离颗粒琼脂糖3000~5000g 1min。
·不要高速离心7、取出10ul（1%）上清液作为“Input”并放在4℃直到步骤D-1。
8、收集剩余的上清液，分装到1ml的微型管中，倒掉颗粒。
9、加入免疫沉淀抗体·阳性对照anti-RNA Polymerase，加1.0 μg抗体每管。
·阴性对照Normal mouse IgG，1.0 μg抗体每管。
·用户使用的抗体和对照，每管加1~10 μg抗体每管（根据抗体效价进行调整）。
10、4℃旋转孵育过夜。
11、每个IP加60ul protein G Agarose4度颠转一小时。
12、将Protein A magnetic beads瞬离（3000~5000g,1min）沉淀下来并除去上清。
13、用1 ml下列冷的缓冲液洗脱Protein A bead-antibody/chromatincomplex，每次在旋转台上孵育3~5 min，瞬离（3000~5000g,1min）并小心的除去上清。
a、Low Salt Immune Complex Wash Buffer (Cat.# 20-154), one washb、High Salt Immune Complex Wash Buffer (Cat.# 20-155), one washc、LiCl Immune Complex Wash Buffer (Cat.# 20-156), one washd、TE Buffer (Cat.# 20-157), two washD、洗脱Protein/DNA复合物实验前准备：·1M NaHCO3放至室温，·打开水浴锅温度调至65℃。
（E部分用）1、为所有的IP管和Input管准备最终的的洗脱液。
·每管用的洗脱液200ul(10ul 20% SDS,20 ul 1M NaHCO3, 170ul 无菌水，蒸馏水）。
2、准备一个大的收集管，比如，是个收集管混合一起是105ul 20%SDS,210ul 1MNaHCO3,1.785ml 无菌水，蒸馏水。
3、Input收集管（C-7）中加入200ul elution buffer 放至室温直到E 部分。
4、往所有的收集管中加入100ul lution buffer，包括antibody/agarose 复合物。
轻轻混匀。
5、室温孵育15min.6、瞬离（3000~5000g,1 min）收集琼脂糖,将上清液吸至一个新的收集管中。
7、重复4-6步，将洗脱液收集起（总共约200ul）。
E、反交联Protein/DNA复合物为单独的DNA。
1、所有收集管包活IP和input加入8ul 5M NaCl,65度孵育4~5小时或过夜。
解交联DNA与蛋白复合物，这一步的样品可放于负20度第二天再用。
2、所有的收集管加入1ul RNase 37度孵育30min.3、每个收集管中加入4ul 0.5M EDTA,8ul 1M Tris-Hcl, 1ul Protocol K，42度孵育1-2小时。
F、DNA Purification Using Spin Columns1、取出Spin Filter到Collection Tube中。
从E一个样本对应一个分离管。
2、加1 ml Bind Reagent “A”到每个200 μl的DNA样品管中（包括ip和input）并混匀。
· 5倍体积的Bind Reagent “A”用于1倍体积的样品，可能有沉淀，但不影响。
3、将600 ul sample/Bind Reagent “A”混合液转移到Spin Filter收集管中。
4、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。
5、从离心管中移除Spin Filter保留将Collection Tube，并将离心液除去。
·如果第2部形成的沉淀物能够在底部看到，但不影响实验。
6、将Spin Filter放回Collection Tube。
7、将剩余的600 ul sample/Bind Reagent “A”(从第二步来) 吸到Spin Filter中并重复4-6。
8、加500 ul Wash Reagent “B”,到收集管的Spin Filter。
9、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。
10、从离心管中移除Spin Filter保留将Collection Tube，并将离心液除去。
11、把空的Spin Filter放回same Collection Tube中。
12、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。
13、除去Collection Tube中的液体。
14、将Spin Filter放到一个干净clean的Collection Tube中。
15、将50 ul Elution Buffer “C”加到Spin Filte的膜中心上。
16、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。
17、除去Spin Filte，洗脱液就是纯化的DNA，可以用于检测或存于-20℃。