代谢工程—周奕腾改+试卷

红色为11级真题试卷
1.代谢工程:利用基因工程技术,有目的地对细胞代谢途径进行精确的修饰、改造或扩展、构建新的代谢途径,以改变生物体原有代谢特性,并与基因调控、代谢调控及生化工程相结合,提高目的代谢产物活性或产量、或合成新的代谢产物的工程技术科学。

2.代谢工程的四大助手：1.组学技术,计算系统生物学,这两种技术有助于代谢工程的分析方面
2.蛋白质工程,合成生物学,有助于代谢工程的基因操作方面.
3.三大代谢途径：糖酵解（EMP）、三羧酸循环（TCA）、磷酸戊糖途径（HMP）或称PPP
4.两个应用实例：
A、添加物导致代谢途径酶活加强：加维生素增强了磷酸果糖激酶活性和乳酸脱氢酶活性，增强了乳酸的生产
B、加入葡萄糖酸钙能促进高6一磷酸葡萄糖脱氢酶和葡萄糖激酶的酶活力，促进了肌苷的合成
4、酶调节方式、反馈调节方式：
5、操纵子：指启动基因、操纵基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称。

转录的功能单位。

很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括结构基因以及调节基因的整个DNA序列。

主要见于原核生物的转录调控，如乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、组氨酸操纵子、色氨酸操纵子等
6、分支代谢调节途径：
A.同功酶调节：催化相同反应，但酶分子结构有差异；
B.协同反馈抑制：一个不能少；
C.累积反馈抑制：按比例累加，无协同效应，无拮抗作用；
D.增效反馈抑制：1+1>2
(末端产物Y和Z单独过量时，各自对途径中第一个酶E1仅产生较小的抑制作用，一种末端产物过量并不影响其他末端产物的形成。

只有当Y和Z同时过量，才能对E1产生较大的抑制作用。

)
E.顺序反馈抑制：按①→②→③顺序逐步抑制；
F.联合激活或抑制调节：途径产物各自调节，同一中间产物；
7、会计算累积反馈抑制（试卷时60%，20%，68%）
如30%和40%：30%*（100%-40%）+40%=58%
8、不同谷氨酸生产菌的两大特征：α-酮戊二酸脱氢酶的缺乏;对生物素的需要(生物素缺陷型)
9、代谢流(物流/通量)(flux)指流入代谢物经该途径转变为流出物的速率。

10、代谢流分析(metabolic flux analysis)：又称代谢通量分析，一种计算流经各种途径的通量的技术，用于描述不同途径的相互作用和围绕支点的物流分布。

11、代谢设计原理：提高通向目标产物的代谢流；扩展代谢途径；构建新的代谢途径
12、代谢工程研究的基本程序：改良靶点的确定；基因操作；效果分析
13、基因操作：基因过量表达，基因敲除，异源基因导入
14、四大组学：基因组学与比较基因组学；转录组学；蛋白质组学；代谢组学
15、英文简称：
LC：液相色谱；GC：气相色谱；GC-MS：气质联用仪；NMR：核磁共振；HPLC:高效液相色谱；CE：毛细管电泳；2-DE：双向凝胶电泳；DIMS：直接注射质谱；FT-IR：傅立叶转换红外色谱；IEF：等电聚焦；ESI—MS：电喷雾质谱；RI：示差折光检测法；UV：紫外检测法；15、比较基因组学:在基因组图谱和序列分析的基础上，对已知基因和基因的结构进行比较，了解基因的功能、表达调控机制和物种进化过程的学科。

16、代谢工程的基本研究思路
其中设计策略是基础，遗传修饰是关键，代谢分析则决定是否需要进行新一轮的代谢工程循环。

17、代谢通量分析：代谢通量的概念、胞内通量的确定方法以及通过代谢通量的系统研究所得到的结论，统称为代谢通量分析
18、代谢通量计算（入为+，出为—）
18、AX(t)=0
如果方程数小于反应速率数目（代谢通量），方程有无数解或不确定解，称为不定系统。

如果方程数大于反应速率数目，称为超定系统。

19、载流途径：是代谢网络中的一部分途径首尾相衔接形成的一条从原料化合物到目的产物的途径。

20、设计育种以及发酵工艺控制的的五字策略：“进、通、节、堵、出”
①进，促进细胞对碳源营养物质的吸收；
②通，使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物；
③节，阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物；
④堵，消除或削弱目的产物进一步代谢的途径；
⑤出，促进目的产物向胞外空间分泌。

21、节点：即代谢网络的分支点，是代谢网络中一个反应序列分叉成两条或更多条不同途径的一些点（代谢物）。

主节点：虽然一个代谢网络由大量的节点组成，一般相信在相当少的节点处的分配比实际上影响着终产物的得率，这些节点称为主节点。

节点的分配比：节点输出途径的代谢流的比值。

22、柔性节点：若流入每一分支的流量容易改变以满足需求，这样的节点称为柔性节点(flexible node)。

刚性节点：若一个节点的一个或多个分支的分配率被严密控制，则称该节点是强刚性的。

半柔性（弱刚性）节点：若在一个节点的流量分配，由它的一个分支的动力学占优势，则称该节点是半柔性（弱刚性）节点。

23、会判断（柔性节点，分配比可变，总量相同。

刚性节点分配比不变，比例相同）
节点1柔性节点2刚性：削弱B1的代谢通量，1增大，P变大
削弱B2的代谢通量，P变小
节点1刚性节点2柔性：削弱B1的代谢通量，1减小，P变小
削弱B2的代谢通量,P增加
若节点1或节点2为刚性时，B1增大，P1增大，P2减小。

分3种情况
1.增加的＞减少的，P增大
2.增加的＜减少的，P减小
3.增加的≈减少的，P不变
24、13C MFA原理与方法：利用同位素标记底物及NMR或GC-MS(气相色谱-质谱仪)分析胞内代谢物的标记模式，可对单一碳原子建立碳平衡方程，从而将辅助因子的平衡方程排除在外。

此外，由于有许多单一碳原子平衡方程可供利用，常得到一个超定系统。

这种方程冗余能更加准确地估算未知通量
1)（拟）稳态假设是MFA的重要前提。

代谢稳态和同位素平衡状态
2) 标记底物的选择必须慎重考虑。

要合理设计标记底物组合方式以获得最大通量信息。

3) 为降低实验中底物用量方面的花费，生物反应器容积应尽量小。

但反应器容积太小系统的稳定条件便很难达到。

因此目前使用的生物反应器容积通常在300-1000mL。

4) 在样品处理方面，对不同代谢物应选择合适的样品处理方法以保证化合物结构不被破坏。

25、作为运载体必须具备哪些条件？
1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。

2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。

3）具有某些标记基因，便于进行筛选。

如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。

26、基因操作的基本步骤：1、目的基因的获取；2、基因表达载体的构建；3、将目的基因导入受体细胞；4、目的基因的检测与鉴定
27、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成。

目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因
28、利用PCR技术扩增目的基因
①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

②原理：DNA复制
③条件：已知基因的核苷酸序列、四种脱氧核苷酸、一对引物(做启动子)、DNA聚合酶.前提条件：
④方式：以指数方式扩增，即2^n（n为扩增循环的次数）
⑤结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。

29、PCR反应的过程：（高温）变性、（低温）退火、（适温）延伸
30、同源重组（英语：Homologous recombination）是遗传重组的一种类型，指两股具有相似序列的DNA的重新排列，使遗传物质发生交换。

可发生于自然界中，或应用于人工的分子生物学技术。

31、非同源重组又包括位点专一重组和非常规重组。

32、通过非基因定向改变的方法包括：定向生物合成、杂交生物合成、突变生物合成，以及生物转化与组合生物转化。

论述题
1、以大肠杆菌为宿主构建乙醇代谢工程生产菌和以酿酒酵母为宿主构建乙醇代谢工程生产菌各有什么优缺点？大肠杆菌优点：
（1）底物谱宽，可以在廉价培养基上生长，含有木糖代谢基因，可以利用木糖；（2）适合高密度培养，生长速率快；
（3）大肠杆菌的生理和遗传背景清楚，有利于复杂遗传操作。

（4）在好氧和无氧条件下均能产生乙醇。

缺点：（1）代谢副产物复杂，比如产生乙酸等副产物
（2）对产物乙醇的耐受能力低，不利于积累高浓度乙醇。

酵母优点：
（1）厌氧生产乙醇时，代谢副产物少，对乙醇的耐受能力高，有利于积累高浓度乙醇。

（2）适合高密度培养。

缺点：底物谱不够宽，常用的酿酒酵母以粮食为原料，高产乙醇但是不能利用木糖，也就不能利用自然界中大量存在的木质纤维素。

即使能发酵木糖也会产生副产物。

遗传改造有一定困难：把其它菌的木糖异构酶基因导入到酿酒酵母，比如E.coli和B.subtilis 的木糖异构酶基因，但都没有成功，有一定难度。

2、已知谷氨酸棒杆菌中色氨酸的生物合成途径和代谢调节机制如图3所示。

试述色氨酸工程菌株的代谢设计策略。

图3谷氨酸棒杆菌中色氨酸生物合成途径及其代谢调节机制
答：（代谢途径描述：色氨酸属于芳香族氨基酸，在生物体内存在严格的调控机制。

谷氨酸棒杆菌中色氨酸的生物合成途径和代谢调节机制如图所示。

在谷氨酸棒杆菌
中，葡萄糖经EMP途径和HMP途径分别生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤藓
糖(EP)，两者在DAHP合成酶(DS)的催化下生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)。

DAHP经三步酶促反应生成莽草酸，莽草酸经三步酶促反应生成分支酸。

由分支酸产生两个分支：一方面，在邻氨基苯甲酸合成酶(AS)催化下合成邻氨基苯甲酸，邻氨基苯甲酸在邻氨基苯甲酸磷酸核糖移换酶(PRT)、色氨酸合成酶(TS)的催化下合成色氨酸；另一方面，分支酸在分支酸变位酶(CM)的催化下生成预苯酸(PPA)。

由预苯酸又产生两个分支：在预苯酸脱氢酶(PD)的作用下生成对羟基苯丙酮酸，再生成酪氨酸；在预苯酸脱水酶(PT)的作用下生成苯丙酮酸，最后合成苯丙氨酸。

在分支酸处，倾向于优先合成邻氨基苯甲酸；在预苯酸处，倾向于优先合成对羟基苯丙酮酸。

）（1）加速限速反应
为了积累更多的色氨酸，必须更多地增加前体物，其中包括减少PEP和EP的支路代谢，解除苯丙氨酸和酪氨酸对DS的反馈调节，增加分支酸的浓度等方法。

为了积累更多的PEP，防止丙酮酸生成更多的草酰乙酸，可以选育磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸激酶活力低的菌株或者选育硫辛酸和硫胺素(分别为丙酮酸脱羧酶系和丙酮酸羧化酶系的辅酶)双重缺陷突变株。

将编码限速酶的基因通过基因扩增，增加拷贝数并在宿主中表达以实现目的产物产率的提高。

首先，必须确定代谢途径中的限速反应及其关键酶。

然后，将编码限速酶的基因通过酶切等手段，制得特定片段，连接在高拷贝数的载体上再导入宿主中去表达。

编码色氨酸生物合成途径中的限速酶的基因有DS酶基因、trpE、trpD、trpC、trpB、trpA等。

trpE、trpD、trpC、trpB、trpA这五种结构基因集中在DNA的某一范围内，被同一个调节基因所控制，形成色氨酸操纵子。

将与色氨酸合成有关的基因克隆到质粒pDTS9901上，然后导入色氨酸生产菌BPS-13中,在500ml培养基中30℃通风培养，可产色氨酸35.2g/L（亲株产20.1g/L）。

研究发现，如果使大肠杆菌中色氨酸操纵子中的弱化子缺失，则trp基因表达量可提高六倍，而且无论是在阻遏细胞内还是在永久性突变的细胞内都是这样（即无论trpR+或trpR-）。

因此，如果给色氨酸生产菌定向带上色氨酸弱化子缺失标记，必然会提高色氨酸的产量。

（2）改变分支代谢途径流向
提高代谢分支点某一分支代谢途径的酶活力，使其在与另外的分支代谢途径的竞争中占据优势，可以提高目的代谢产物的产量。

芳香族氨基酸生物合成中，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三条支路上的任何一条支路的酶活性被加强，其与另两条支路的竞争将占据优势。

通过同时加强色氨酸支路代谢流和弱化苯丙氨酸、酪氨酸代谢流，可以实现色氨酸支路的最大代谢通量。

例如，将合成色氨酸的多酶基因与DS基因克隆到谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中，构建出色氨酸工程菌，它促使了Trp 支路第一个产物氨茴酸Ant的生成，并通过突变解除Trp对该质粒所编码的Ant合成酶和Ant磷酸核糖基转移酶的反馈抑制，结果色氨酸产量达43g/L。

若再将苯丙氨酸合成相关的酶基因如pheA基因敲除，则可使色氨酸产生菌产酸达50g/L。

另外，切
断由分支酸到预苯酸、VK、CoQ的代谢支路，可节约碳源，使中间产物分支酸更多
地转向合成色氨酸，而且还可以解除苯丙氨酸、酪氨酸对合成途径中DS的反馈调节，
从而有利于色氨酸积累。

具体可采用构建预苯酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、酪氨酸缺陷、
VK缺陷、CoQ缺陷等代谢改造措施。

据报道，有人以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，经
代谢改造得到的KY9456 (Phe-+Tyr-)菌株可积累L-色氨酸0.15g/L。

这个产量是很低
的，由此也可看出只构建缺陷型是不够的，还必须解除由色氨酸引起的反馈调节。

（3）构建AS酶缺陷的回复突变株，可增加色氨酸的积累。

因为当AS-的突变株发
生回复突变时，往往是恢复了酶的活性中心，而其调节中心并没有恢复，因此该酶的
调节中心并不能与色氨酸结合，所以解除了色氨酸的反馈抑制，而该酶的催化活性不
变，因此导致色氨酸的大量积累。

同理，构建DS酶缺陷的回复突变株，可增加色氨
酸的前体物DAHP，因此也有利于色氨酸的生物合成。

（4）加强HMP途径，有利于PEP和EP的生成，从而增加色氨酸合成的前体物，
提高色氨酸产生菌株的产酸率。

（5）切断进一步代谢途径，通过构建色氨酸酶(TN)缺失突变株，色氨酸脱羧酶缺失突变株，色氨酰-tRNA合成酶缺失突变株以及不分解利用色氨酸的突变株，可以减少色氨酸的消耗，从而有利于色氨酸的积累。

红色为试卷题目，其他为复习内容，希望大家加油~~~~。