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兰大党课课件 李宝刚
在社会主义革命和建设时期，我们 确立了社会主义基本制度，在一穷二白 的基础上建立了独立的比较完整的工业 体系和国民经济体系，使古老的中国以 崭新的姿态屹立在世界的东方。
在改革开放和社会主义现代化建设时期， 我们开创了中国特色社会主义道路，坚持以 经济建设为中心、坚持四项基本原则、坚持 改革开放，初步建立起社会主义市场经济体 制，大幅度提高了中国的综合国力和人民生 活水平，为全面建设小康社会、基本实现社 会主义现代化开辟了广阔的前景。
兰州大学党课
中国共产党的性质、党的先进性和 党的执政能力
主讲人 李宝刚
讲授大纲
• • • • 中国共产党性质的表述及其内涵 党的先进性和保持党的先进性的依据 党的执政能力 中国梦必须以个人梦为基础。*
讲授要点：
（1）两个“先锋队”的内涵及相互之间的关 系； （2）中国共产党是中国特色社会主义事业的 领导核心； （3）要加强党的执政能力建设和先进性建设， 全面推进党的思想建设、组织建设、作风建设 和制度建设；
为人民服务思想的理论渊源 无产阶级只有解放全人类，才 能最后解放无产阶级自己。
为人民服务宗旨的任务层次
• • • • 对全党的要求 对各级党组织的要求 对党员领导干部的要求 对每一位共产党员的要求
朱彦夫
***
全党必须牢记，党的先进性和 党的执政地位都不是一劳永逸、一 成不变的，过去先进不等于现在先 进，现在先进不等于永远先进；过 去拥有不等于现在拥有，现在拥有 不等于永远拥有。* * * * * * * *
——无产阶级（工人阶级）
中国共产党是两个先锋队
第一个先锋队： 党的阶级基础—工人阶级的先锋队—先进性 第二个先锋队： 党的群众基础—中国人民的先锋队—人民性 党的执政基础—中华民族的先锋队—民族性（综 合概括）
兰州大学化学化工学院有机化学课件 第1章 绪论
随着时间的推移，需要解决的问题的难度也逐步提高，这
就需要不断发现新方法、新技术和新理论，而所获得的成 就反过来丰富了有机化学学科。
第二节 有机化合物的特点及结构表示
一、有机物的特点
表1-1 简化的周期表 第一周期 第二周期 第三周期 H Li Na Be Mg B Al C Si N P O S F Cl Br I
随着有机元素分析技术日益成熟，发现在有机物中只含 为数有限的几种元素，所有的有机化合物都含有碳，多 数含有氢，其次为含有O、N、X、P等，碳是最基本的 元素。
1848年，葛美林(Gmelin L.)提出新有机化学概念：有 机 化 学 是 研 究 碳 化 合 物 的 化 学 ； 1874 年 ， 肖 莱 马 (Schorlemmer C.)完善了有机化学概念：有机化学是 研究碳氢化合物及其衍生物的化学，有机化合物—碳 氢化合物及其衍生物。 然而，有机化学发展成为一门独立的、系统的科学 则是在有机化学结构理论建立以后才完成的。
环形化合物
杂环化合物
二、按官能团分类
某些原子或原子团与不同的碳骨架连接时都表现出性质的相对 一致性，把这些原子或原子团称为官能团。如羟基-OH是醇的 官能团。
烷烃 (Alkanes)
烯烃 (Alkenes)
炔烃 (Alkynes) 芳烃 (Aromatic Hydrocarbons) 卤代烃 (Alkyl Halides)
蔗糖 尿素 酒石酸 柠檬酸 乳酸 吗啡
甘蔗 尿液 葡萄 柠檬 酸牛奶 鸦片
瑞典化学家柏则里(J .Berzelius)，为区别于无机物及无
机化学,第一个提出了有机化学的概念：研究有机物的化 学为有机化学，并提出了第一个说明有机物产生的学 说—生命力论(活力论)，认为:一切有机物只有在生命力 存在下才能形成，从无机物不能合成有机物（生命力学
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4.2 血红蛋白的结构与功能 主要内容有：血红蛋白的结构、氧合过程的构象变化和别构效应。 4.2.1 血红蛋白的结构
血红蛋白由四个亚基 组成，两个α和两个β 链，一条α和另一条β 链构成血红蛋白的一 个原体。 人在不同的发育时期 血红蛋白的亚基的种 类是不同的，成人的 血红蛋白主要是Hb A (Hb A1)，其亚基组 成为α2β2 。 Hb A1c是Hb A的葡糖 基化变异形式，与血 中的葡萄糖浓度相关， 临床上可作为血糖控 制的指标。
肌红蛋白分子呈扁平 的菱形，分子大小约 为4.5nm × 3.5nm × 2.5nm，分子中多肽 的主链有长短不同的 8段直的螺旋构成， 这8段螺旋分别命名 为A、B、C、D、E、 F、G、H，相应的非 螺旋区肽段称为NA、 AB、BC~GH、HC， 个残基处有一套从N 端开始计算的序列号 外，还按在个螺旋中 的位置另外给出编号。 8个螺旋大体上 组装成两层，构成肌红蛋白的单结构域。拐弯处的螺旋受到破坏，拐弯是由 1~8个Aa组成的无规卷曲，C-末端由一个5个Aa的松散肽段。肌红蛋白的分 子十分致密结实，分子内部只有一个能容纳4个水分子的空间。
Y=
肌红蛋白的氧合曲线为一双曲线，它的两条渐近线是Y=1和 p(O2 )= -K。当Y=1，所有肌红蛋白的氧结合部位均被氧所占 据，即肌红蛋白处于氧饱和的状态。当Y=0.5时， p(O2 )= K ＝ P50 ，或P0.5.。 P50指肌红蛋白处于氧半饱和时的氧分压。
当Y=0.5时， p(O2 )= K ＝ P50 ，或P0.5.。 P50指肌红蛋白处于氧半饱和时的氧分压。
4.2.3 血红蛋白的协同性氧结合
血红蛋白结构和功能上都较肌红蛋白(Mb)复杂：四聚体的结构； 输送氧气外，还输送H+和二氧化碳。
南京大学分子生物学课件1-3讲
DNA双螺旋结构的发现
1953年，詹姆斯·沃森和弗朗西斯·克 里克发现了DNA双螺旋结构，为现代 分子生物学的发展奠定了基础。
分子生物学的研究内容与学习方法
研究内容
分子生物学的研究内容包括基因组学、蛋白质组学、代谢组学、细胞信号转导 等，涉及生物大分子的结构、功能、相互作用以及调控机制等方面。
学习方法
04
细胞信号转导
信号转导的概述
信号转导的定义
信号转导是指细胞对外界信号刺激作出反应的过程，通过一系列的化学和物理变化，将信 号传递到细胞内部并引发相应的生物学效应。
信号转导的分类
根据信号分子的不同，信号转导可以分为亲脂性和亲水性信号转导。亲脂性信号转导主要 涉及脂溶性信号分子，如激素和神经递质；亲水性信号转导则涉及水溶性信号分子，如生 长因子和细胞因子。
总结词
蛋白质的功能主要取决于其特定的空间结构和氨基酸序列，而活性调节则涉及到蛋白质与其他分子的 相互作用。
详细描述
蛋白质的功能与其特定的空间结构和氨基酸序列密切相关，不同的结构和序列决定了蛋白质在细胞中 的不同作用。此外，蛋白质的活性还受到其他分子的调节，如激素、离子等，这些分子通过与蛋白质 结合来调节其活性。
05
生物大分子相互作用网络
蛋白质相互作用网络
蛋白质相互作用类型
01
包括同源相互作用、异源相互作用和自相互作用等。
蛋白质相互作用在细胞中的功能
02
参与细胞信号转导、物质运输、细胞周期调控等重要生命活动
。
蛋白质相互作用网络的构建方法
03
通过酵母双杂交、免疫共沉淀等方法进行蛋白质相互作用网络
的构建。
基因与蛋白质相互作用网络
基因与蛋白质的相互关系：基因编码 蛋白质，蛋白质可以调控基因的表达 。
兰州大学化学化工学院有机化学课件 第7章 烯烃 亲电加成反应
C
C
cis-2-丁烯
trans-2-丁烯
如果一个双键碳上连有两个相同的取代基，则不存在顺反异构体，例如：
H H C C
CH3 Cl
H3CH2C H C C
CH3 CH3
7.3.2 Z、E命名
cis、trans（顺、反）命名体系只适用于双键碳上各有一个相同的
原子或相同取代基的烯烃，当烯烃分子含取代基不同的三取代或四 取代双键时，无法用cis、trans或顺、反来命名其构型，可采用Z、E 命名
u=
2 x C数 +2-(H数 + X数 )
2
（2）含C、H、O的有机分子 由于氧形成两个键，不影响分子的碳氢个数，因此计 算分子的饱和度时，可以忽略氧的存在。
（3）含C、H、N的有机分子
由于氮形成三个键，因此有机氮化合物比相应的烃多一个氢，例如， C-C变成C-NH-C或C-H变成C-NH2均多了一个氢，如果含两个氮则 多两个氢，于是在计算不饱和度时，应从氢数中减去氮的数目。
+
CH3CH2CH=CH2
热裂过程是自由基反应，涉及到多种自由基，产物很复杂。
CH3 CH3CH2CH2CH3
+
CH2 CH3CH3
CH4 +
CH3CH=CH2 2CH2 =CH2 + H2 CH3CH2CH=CH2+ H2
CH3CH2 + CH2CH3 H + CH2CH2CH3 CH3
7．2 烯烃和其它有机分子的不饱和度
因此正电荷不再是定域在一个原子上，而是离域到更大的空间，即 产生了p-σ超共轭作用（见图7.4），因此稳定了碳正离子。
碳正离子上的烷基越多，超共轭作用发生的机会越多，碳正离子的 稳定性越大。
兰大李炳瑞结构化学课件(04) 第四章 分子对称性与群论初步
单轴群: 包括Cn 、Cnh 、Cnv 点群. 这类点群的共同特点是旋转轴只有一条.
Cn 群：只有一条n次旋转轴Cn .
R2 R2
R2
R1
R1
R1
R2
R1
C2 群
C3群
C3通过分子中心且垂直于荧光屏
Cnh群 :
除有一条n次旋转轴Cn外，还有与之垂直的一个镜面σh .
C2h群: 反式二氯乙烯
C2h群: N2F2
这类点群的共同特点是有多条高次(大于二次)旋转轴相交.
Td 群：属于该群的分子，对称性与正四面体完全相同。
CH4
P4 （白磷）
Td 群是24阶群： E ，8C3 ，3C2 ，6S4 ，6σd .
从正四面体上可以清楚地看出Td 群的对称性. 也可 以把它放进一个正方体中去看. 不过要记住：你要观察 的是正四面体的对称性，而不是正方体的对称性!
[Co(NH2CH2CH2NH2)3]3+是一实例.
何其相似！
唯一的C3旋转轴从xyz轴连成的 正三角形中心穿过, 通向Co; C2
三条C2旋转轴分别从每个N–N
x
键中心穿过通向Co.
C2 z
y
C2
Dnh : 在Dn 基础上，还有垂直于主轴的镜面σh .
D2h 群 ：N2O4
D2h群：乙烯
主轴垂直于荧光屏. σh在荧光屏上.
D3h 群 ： 乙烷重叠型
D4h群：XeF4
D6h群：苯
Dh群： I3-
Dnd: 在Dn基础上, 增加了n个包含主轴且平分二次副轴
夹角的镜面σd.
D2d : 丙二烯
D2d : B2Cl4
D3d : 乙烷交错型
D4d ：单质硫
第5章多原子分子的结构与性质－2012年兰州大学李炳瑞最新结构化学课件
第5章目录5.1 非金属元素的结构化学:8-N法则5.2 非共轭分子几何构型与VSEPR规则5.3 分子几何构型与Walsh规则5.4 共轭分子与SHMO法5.4.1 丁二烯离域大π键的SHMO处理5.4.2 简并轨道的求解与等贡献规则5.4.3 直链和单环共轭体系本征值的图解法5.4.4 分子图：π电子密度、π键级、自由价5.4.5 共轭效应5.4.6 共轭分子在现代科技中的应用5.4.7 超共轭效应5.5 饱和分子的正则轨道与定域轨道5.6 缺电子分子的结构5.6.1 缺电子原子化合物的三种类型5.6.2 硼烷中的多中心键5.6.3 金属烷基化合物中的多中心键5.7 等瓣类似性关系5.7.1 等瓣类似性概念5.7.2 八面体构型金属-配体碎片与有机碎片的等瓣类似性5.7.3 其他构型的金属-配体碎片与有机碎片的等瓣类似性5.7.4 各种配位的分子碎片的等瓣类似关系小结5.7.5 等瓣类似性原理的应用实例5.8 多原子分子的谱项5.8.1 电子组态与分子谱项5.8.2 荧光与磷光5.9 配位场理论5.9.1 晶体场理论(CFT)5.9.2 配位场理论(LFT)5.9.3 T-S图与电子光谱5.10 分子轨道对称性守恒原理5.10.1 前线轨道理论5.10.2 相关图理论与金属相比, 非金属的数量要少得多。
目前在元素周期表中有110多种元素,非金属元素只占20余种, 分布在p 区(除H 的位置有不同看法外)。
在p 区中,整个一列稀有气体都是非金属元素，其余非金属元素很有规律地占据了右上角区域。
非金属元素数量虽少，但成键规律、结构特征都与金属元素有所不同。
非金属单质中定域共价键占主导地位，与金属单质中金属键占主导地位形成鲜明的对照。
金属键没有饱和性和方向性。
对于金属单质结构，几何因素起重要作用, 大多数金属单质晶体采取简单的密堆积结构。
共价键有饱和性和方向性。
非金属原子以共价单键结合时，周围通常配置8-N个原子，非金属间化合物配位也如此。
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3. 来源。广泛存在于自然界。在体内，Trp能转变 为维生素PP。
9.2.3 维生素B2和黄素辅酶 1. 结构。维生素B2又名核黄素(riboflavin),是核酸与7,8-二 甲基异咯嗪的衍生物，异咯嗪的1,5两位具有活泼的双键， 易起氧化还原反应，所以有氧化和还原两种形式。 2. 功能 (1) 在生物体内的氧化还原过程中起着传递氢的作用。 体内，核黄素以黄素单核苷酸(flavin mononucleotide, FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)形式存在，是生物体内一些氧化还原酶(黄素蛋白)的 辅酶，与蛋白质的结合很牢。黄素是比NAD+和NADP+更 强的氧化剂，能被1、2个电子途径还原，并且很容易被分 子氧重氧化。 (2) 维生素B2能促进糖、脂肪和蛋白质的代谢，对维持皮肤 、粘膜和视觉的正常机能均有一定的作用。
2. 功能 (1) 维生素E极易氧化而保护其他的物质不被氧化，是动物和 人体中最为有效的抗氧化剂。能够对抗生物膜磷脂中不 饱和脂肪酸的过氧化反应，因而避免脂质中过氧化物产 生，保护生物膜的结构和功能。
可与硒(Se)协同通过谷胱甘肽过氧化酶发挥抗氧化作用。 (2) 与动物的生育有关，缺乏时，动物的生殖器官受损而不育 。 (3) 能提高血红素合成过程中δ-氨基γ-酮戊酸(ALA)合成酶和 ALA脱水酶的活性，从而促进血红素合成。 3. 缺乏症 一般不容易缺乏。缺乏时表现为红细胞数量少，寿命缩短 。体外实验见到红细胞脆性增加，常表现为贫血或血小板 增多症。 4. 来源 主要存在于植物油中。
2. 功能 主要起传递酰基的作用。 (1) 通过亲核攻击并转移活化的酰基。
(2) 吸取一个H+活化酰基的α-氢。
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Chapter 12. 核酸的研究方法
1. 2. 3. 4. 5. 核酸的分离、提纯和定量测定 核酸的超离心 核酸的凝胶电泳 核酸的核苷酸序列测定 DNA聚合酶链式反应
15.1 核酸的分离、提纯和定量测定
15.1.1 DNA的分离 DNP溶解于水和浓盐溶液(1 mol/LNaCl)，但不 溶于生理盐溶液(0.14 mol/L NaCl)。据此可以 将DNP和RNP分离开。 除去蛋白质的方法有: (1) 苯酚法；(2) 氯仿-辛 醇(或异戊醇)法。 为避免核酸酶和机械振荡对DNA的降解，要在 细胞提取液中直接加入2倍体积的含有1%十二 烷基硫酸钠(SDS)的缓冲溶液，并加入广谱蛋白 酶使蛋白质全部降解。 CsCl密度梯度离心也能制备高质量的DNA。
2. DNA酶法测序——加减法
以单连DNA为模板， 加入适当的引物，四种 dNTP(一种用放射性标记 )和DNA聚合酶使反应， 反应是随机的并将产生各 种长度的片段。将反应物 分成8组，四组用于加法 系统：每组分别只加入一 种dNTP；减法系统中每 次只加入三种dNTP，分 别减去四种脱氧核糖核苷 酸中的一种。 最后将各组样品在含 变性剂的聚丙烯酰胺凝胶 电泳，放射自显影后就可 以读出。
15.1.2 RNA的分离
RNA的提取特别要注意的是要防止RNase的降解， 为此要注意三点: （1）所用的玻璃器皿要用 各种方法除尽蛋白质（RNase）；(2) 在破碎 细胞的同时要加入强变性剂破坏RNase；在 反应体系内加入RNase酶的抑制剂。 目前提取RNA的方法有两种： 1. 用酸性盐酸胍盐／苯酚／氯仿抽提。此法用 于小量制备。 2. 用盐酸胍盐／氯化铯将细胞抽提物进行密度 梯度离心。可制备较大量高纯度的RNA。 分离寡聚核苷酸也可用亲和层析法。
3. DNA酶法测序——双脱氧法
4. DNA测序——化学法 化学法由Maxam和Gilbert(1977)发明的，其 原理是用特异的化学修饰剂修饰DNA中的不 同碱基，然后用哌啶切断多核苷酸。用四组 不同的特异反应，就可以将末端用放射性标 记的DNA分子形成长度不同的寡核苷酸。这 些寡核苷酸的长度相当于从特异反应引起的 切点到标记末端之间的长度。再用凝胶电泳 就可以把不同长度的寡核苷酸分离开来。 四组特异反应： (1) G反应； (2) G+A反应； (3) T+C 反应； (4) C反应。
核酸密度的测定 方法有二：一是直接用CsCl密度梯度离心，当 DNA样品的沉降速度与扩散速度平衡时，DNA 形成一稳定的区带，此时DNA所处位置的CsCl密 度就是DNA的浮力密度。其二是用已知密度的标 准DNA为参考与待测的DNA一起离心。待达到 平衡，通过离心机上的光学系统测定DNA与转头 的中心轴之间的距离后就可以计算出待测DNA的 浮力密度。
琼脂糖凝胶电泳常用于分析DNA。
分析RNA时，必须加入蛋白质变性剂， 如甲醛等。 电泳完毕后将胶用溴化乙锭的水溶液染色， 染色后，DNA在紫外光照射下可发出红橙色荧光。 方法十分灵敏，1 ng的DNA可用此法检 出。
应用: (1) 根据荧光强度 判断DNA的 浓度； (2) 正确测定DNA 片段的分子大 小。 凝胶上的样品可 以回收，以供 进一步研究之 用。
生物组织 冷的稀酸抽提 酸溶性物质 残留物 有机溶剂抽提 脂类物质 残留物
碱法 碱降解再酸化
热酸法 热酸提取
冷酸法 冷酸提取
酸提取液 (RNA)
残留物 (DNA)
残留物
酸抽提液 (DNA + RNA)
残留物
酸提取液 热酸提取 (RNA)
残留物
酸提取液 (DNA)
12.2 核酸的超离心
应用超离心技术，同样可以测定生物大分子的相对分 子质量和沉降常数。测定DNA的相对分子质量时， 要采用极稀的溶液。因为DNA的粘度很大。 分析DNA时，常用氯化铯密度梯度离心，因为CsCl 在水中有极高的溶解度，可以制成浓度很高的溶液 (8.0 mol/L) 。
2. 测定DNA中的G-C含量 G-C对多的DNA浮力密度大，反之则浮力密度小 。G-C的百分含量与DNA的浮力密度成正比关系 ，因此用这个方法能迅速而精确地测定DNA的碱 基成分。用Rolfe-Meselson公式： ρ = 0.100xG-C + 1.658 对于含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其浮力密度降低 ，不能用此公式计算。
5'pGpApTpCpGpGpApCpCpT3'
G反应
G+A反应
T＋C反应
C反应
G
G+A T+C
C
DNA fragment GATCGGACCT GATCGGACC GATCGGAC GATCGGA GATCGG GATCG GATC GAT GA G
12.4.3 RNA的测序 主要方法有三个： 1. 用特异性的酶法。RNase A，水解嘧啶核苷酸 的键，所产生的寡核苷酸的3‘端均为嘧啶核 苷酸；RNase T1，特异性水解G与相邻核苷 酸的键；RNase U2水解A的键；RNase Phy I 水解A、G、U三种核苷酸，但不水解胞苷酸 。 2. 化学试剂法。 3. 逆转录成cDNA ，就可以用DNA测序法来测 定。
3. 溶液中核酸构象的研究 不同构象的核酸具有不同的浮力密度，其具体表 现是：局部双螺旋的RNA>双链DNA>蛋白质。双 螺旋的DNA受热变性后成为单链，密度增高。
4. 用于核酸的制备 应用溴化乙锭-氯化铯 密度梯度平衡超离心， 很容易将不同构象的 DNA、RNA及蛋白质 分开，是目前实验室纯 化质粒DNA最常用的 方法。
12.3 核酸的凝胶电泳 凝胶电泳的优点：简单、快速、灵敏、成本低。常 用的有琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶 电泳。
12.3.1 琼脂糖凝胶电泳 电泳的迁移率决定于以下的因素: (1) 核酸的分子大小； (2)胶浓度； (3)DNA的构象。一般条件下，超螺旋DNA最快， 线型DNA其次，开环DNA最慢。 (4) 迁移率与电压成正比； (5) 碱基组成； (6)温度。4~30度都可以，不宜过高。
12.3.2 聚丙烯酰 胺凝胶电泳
12.4 核苷酸序列测定 12.4.1 DNA的酶法测序 1. DNA聚合酶。DNA聚合酶催化DNA的合成。其特 点是: (1) 以四种脱氧核糖核苷三磷酸酸dNTP为底物； (2) 反应需要模板DNA来指导； (3) 反应必须有引物3-OH存在； (4) DNA链的生长方向为5'-3'； (5) 具有3'-5'核酸外切酶的活性。3'-5'外切酶的活力能 切除单链DNA的3'末端核苷酸，而对双链DNA不 起作用，故不能形成碱基对的错配核苷酸可被该 酶水解下来。对于保证DNA复制的忠实性，保证 遗传信息传递无误具有重要的作用。
15.1.3 核酸含量的测定
1. 核酸含量的测定方法，常用比色法进行。现在也使用 HPLC、毛细管电泳等方法测定。 (1) 紫外分光光度法 (2) 定磷法。常用的是钼蓝比色法。最大吸收峰在660 nm 。 (3) 定糖法。地衣酚法测定RNA含量(670 nm)，二苯胺法 测定DNA含量(595 nm)。 2. 核酸的提取 组织的预处理：常用冷的5%~10%的过氯酸(PCA)或三 氯乙酸(TCA)处理粉碎的生物材料，抽提液为酸溶性部 分，包括核苷酸以及相对分子质量较小的寡核苷酸等 。再将残留物用有机溶剂除去脂溶性含磷物质。脂溶 性抽提液中主要是磷脂类物质。留下的残渣包含有 DNA、RNA、蛋白质及少量其它含磷化合物。
1. 2. 3. 4. 5. 核酸的分离、提纯和定量测定 核酸的超离心 核酸的凝胶电泳 核酸的核苷酸序列测定 DNA聚合酶链式反应
15.1 核酸的分离、提纯和定量测定
15.1.1 DNA的分离 DNP溶解于水和浓盐溶液(1 mol/LNaCl)，但不 溶于生理盐溶液(0.14 mol/L NaCl)。据此可以 将DNP和RNP分离开。 除去蛋白质的方法有: (1) 苯酚法；(2) 氯仿-辛 醇(或异戊醇)法。 为避免核酸酶和机械振荡对DNA的降解，要在 细胞提取液中直接加入2倍体积的含有1%十二 烷基硫酸钠(SDS)的缓冲溶液，并加入广谱蛋白 酶使蛋白质全部降解。 CsCl密度梯度离心也能制备高质量的DNA。
2. DNA酶法测序——加减法
以单连DNA为模板， 加入适当的引物，四种 dNTP(一种用放射性标记 )和DNA聚合酶使反应， 反应是随机的并将产生各 种长度的片段。将反应物 分成8组，四组用于加法 系统：每组分别只加入一 种dNTP；减法系统中每 次只加入三种dNTP，分 别减去四种脱氧核糖核苷 酸中的一种。 最后将各组样品在含 变性剂的聚丙烯酰胺凝胶 电泳，放射自显影后就可 以读出。
15.1.2 RNA的分离
RNA的提取特别要注意的是要防止RNase的降解， 为此要注意三点: （1）所用的玻璃器皿要用 各种方法除尽蛋白质（RNase）；(2) 在破碎 细胞的同时要加入强变性剂破坏RNase；在 反应体系内加入RNase酶的抑制剂。 目前提取RNA的方法有两种： 1. 用酸性盐酸胍盐／苯酚／氯仿抽提。此法用 于小量制备。 2. 用盐酸胍盐／氯化铯将细胞抽提物进行密度 梯度离心。可制备较大量高纯度的RNA。 分离寡聚核苷酸也可用亲和层析法。
3. DNA酶法测序——双脱氧法
4. DNA测序——化学法 化学法由Maxam和Gilbert(1977)发明的，其 原理是用特异的化学修饰剂修饰DNA中的不 同碱基，然后用哌啶切断多核苷酸。用四组 不同的特异反应，就可以将末端用放射性标 记的DNA分子形成长度不同的寡核苷酸。这 些寡核苷酸的长度相当于从特异反应引起的 切点到标记末端之间的长度。再用凝胶电泳 就可以把不同长度的寡核苷酸分离开来。 四组特异反应： (1) G反应； (2) G+A反应； (3) T+C 反应； (4) C反应。
核酸密度的测定 方法有二：一是直接用CsCl密度梯度离心，当 DNA样品的沉降速度与扩散速度平衡时，DNA 形成一稳定的区带，此时DNA所处位置的CsCl密 度就是DNA的浮力密度。其二是用已知密度的标 准DNA为参考与待测的DNA一起离心。待达到 平衡，通过离心机上的光学系统测定DNA与转头 的中心轴之间的距离后就可以计算出待测DNA的 浮力密度。
琼脂糖凝胶电泳常用于分析DNA。
分析RNA时，必须加入蛋白质变性剂， 如甲醛等。 电泳完毕后将胶用溴化乙锭的水溶液染色， 染色后，DNA在紫外光照射下可发出红橙色荧光。 方法十分灵敏，1 ng的DNA可用此法检 出。
应用: (1) 根据荧光强度 判断DNA的 浓度； (2) 正确测定DNA 片段的分子大 小。 凝胶上的样品可 以回收，以供 进一步研究之 用。
生物组织 冷的稀酸抽提 酸溶性物质 残留物 有机溶剂抽提 脂类物质 残留物
碱法 碱降解再酸化
热酸法 热酸提取
冷酸法 冷酸提取
酸提取液 (RNA)
残留物 (DNA)
残留物
酸抽提液 (DNA + RNA)
残留物
酸提取液 热酸提取 (RNA)
残留物
酸提取液 (DNA)
12.2 核酸的超离心
应用超离心技术，同样可以测定生物大分子的相对分 子质量和沉降常数。测定DNA的相对分子质量时， 要采用极稀的溶液。因为DNA的粘度很大。 分析DNA时，常用氯化铯密度梯度离心，因为CsCl 在水中有极高的溶解度，可以制成浓度很高的溶液 (8.0 mol/L) 。
2. 测定DNA中的G-C含量 G-C对多的DNA浮力密度大，反之则浮力密度小 。G-C的百分含量与DNA的浮力密度成正比关系 ，因此用这个方法能迅速而精确地测定DNA的碱 基成分。用Rolfe-Meselson公式： ρ = 0.100xG-C + 1.658 对于含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其浮力密度降低 ，不能用此公式计算。
5'pGpApTpCpGpGpApCpCpT3'
G反应
G+A反应
T＋C反应
C反应
G
G+A T+C
C
DNA fragment GATCGGACCT GATCGGACC GATCGGAC GATCGGA GATCGG GATCG GATC GAT GA G
12.4.3 RNA的测序 主要方法有三个： 1. 用特异性的酶法。RNase A，水解嘧啶核苷酸 的键，所产生的寡核苷酸的3‘端均为嘧啶核 苷酸；RNase T1，特异性水解G与相邻核苷 酸的键；RNase U2水解A的键；RNase Phy I 水解A、G、U三种核苷酸，但不水解胞苷酸 。 2. 化学试剂法。 3. 逆转录成cDNA ，就可以用DNA测序法来测 定。
3. 溶液中核酸构象的研究 不同构象的核酸具有不同的浮力密度，其具体表 现是：局部双螺旋的RNA>双链DNA>蛋白质。双 螺旋的DNA受热变性后成为单链，密度增高。
4. 用于核酸的制备 应用溴化乙锭-氯化铯 密度梯度平衡超离心， 很容易将不同构象的 DNA、RNA及蛋白质 分开，是目前实验室纯 化质粒DNA最常用的 方法。
12.3 核酸的凝胶电泳 凝胶电泳的优点：简单、快速、灵敏、成本低。常 用的有琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶 电泳。
12.3.1 琼脂糖凝胶电泳 电泳的迁移率决定于以下的因素: (1) 核酸的分子大小； (2)胶浓度； (3)DNA的构象。一般条件下，超螺旋DNA最快， 线型DNA其次，开环DNA最慢。 (4) 迁移率与电压成正比； (5) 碱基组成； (6)温度。4~30度都可以，不宜过高。
12.3.2 聚丙烯酰 胺凝胶电泳
12.4 核苷酸序列测定 12.4.1 DNA的酶法测序 1. DNA聚合酶。DNA聚合酶催化DNA的合成。其特 点是: (1) 以四种脱氧核糖核苷三磷酸酸dNTP为底物； (2) 反应需要模板DNA来指导； (3) 反应必须有引物3-OH存在； (4) DNA链的生长方向为5'-3'； (5) 具有3'-5'核酸外切酶的活性。3'-5'外切酶的活力能 切除单链DNA的3'末端核苷酸，而对双链DNA不 起作用，故不能形成碱基对的错配核苷酸可被该 酶水解下来。对于保证DNA复制的忠实性，保证 遗传信息传递无误具有重要的作用。
15.1.3 核酸含量的测定
1. 核酸含量的测定方法，常用比色法进行。现在也使用 HPLC、毛细管电泳等方法测定。 (1) 紫外分光光度法 (2) 定磷法。常用的是钼蓝比色法。最大吸收峰在660 nm 。 (3) 定糖法。地衣酚法测定RNA含量(670 nm)，二苯胺法 测定DNA含量(595 nm)。 2. 核酸的提取 组织的预处理：常用冷的5%~10%的过氯酸(PCA)或三 氯乙酸(TCA)处理粉碎的生物材料，抽提液为酸溶性部 分，包括核苷酸以及相对分子质量较小的寡核苷酸等 。再将残留物用有机溶剂除去脂溶性含磷物质。脂溶 性抽提液中主要是磷脂类物质。留下的残渣包含有 DNA、RNA、蛋白质及少量其它含磷化合物。