黄芩含药血清对细菌脂多糖刺激的小鼠小胶质细胞的保护作用_崔晓燕

IL-6in ischemia side brain tissue were measured by ELISA．Results：Borneolum（0．2g/kg）significantly inhibited abnormal increase of rectal temperature after reperfusion4h，10h，22h in model rats，while moschus（66．6mg/kg）and styrax（1．332g/kg）showed significant inhibition af-ter reperfusion4h and benzoinum（1．0g/kg）showed no effect at all time point．moschus，borneolum and styrax significantly decreased the content of NO in serum in model rats，and moschus and borneolum also inhibited NOS activity in model rat＇s serum．Moschus and borneolum significantly reduced the level of IL-1βand IL-6in ischemia side brain tissue，while styrax and benzoinum had no significant effect on them．Conclusions：Aromatic resuscitation drugs have protective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats，which the effects of borne-olum and moschus are better than styrax．But the effect of benzoinum is inferior to them．The protective mechanism of aromatic resuscitation drugs are partly due to its functions of inhibiting inflammation mediators releasing and anti-neurotoxicity of NO．In addition，significant inhibi-tion of borneolum on abnormal increase of temperature in model rats reflects the difference in nature of herb among this four drugs，which out-stands the"cool"nature of borneolum．Key words aromatic resuscitation drugs；cerebral ischemia-reperfusion injury；IL-1β；IL-6；NO；NOS黄芩含药血清对细菌脂多糖刺激的小鼠小胶质细胞的保护作用崔晓燕，张敏，杜增辉，韩文华（河北省药品检验所，石家庄050011）摘要目的：考察黄芩提取物（SBE）含药血清对细菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激的小鼠小胶质细胞系（N9细胞）的保护作用。

方法：将黄芩提取物灌胃（大鼠）给药后，在0．5 6h内眼眶取血，分离血清，将血清加入LPS刺激造模成功后的N9细胞培养液内，加药后培养24h，检测培养液内NO、MDA、GSH、SOD的含量。

结果：黄芩提取物不同时间的含药血清在不影响细胞的存活率的情况下，可以不同程度的降低LPS刺激后N9细胞培养液内NO及MDA的含量；并不同程度的增加LPS刺激后N9细胞培养液内SOD、GSH的含量。

结论：黄芩提取物的含药血清对LPS刺激的N9细胞具有一定的保护作用。

关键词黄芩提取物；含药血清；细菌脂多糖；一氧化氮；丙二醛；超氧化物歧化酶；谷光甘肽黄芩系唇形科植物Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，本实验所用黄芩产自河北围场，由河北省药品检验所中药室提取鉴定，纯度为81．2%。

本论文主要从细胞分子水平考察了黄芩提取物（SBE）的含药血清对LPS刺激造模成功后的小鼠小胶质细胞系（N9细胞）及大鼠原代小胶质细胞培养液内NO、MDA、SOD、GSH含量的影响。

1材料与方法1．1试验药物黄芩提取物（Scutellaria baicalensis Georgi SBE）：取黄芩，加水煎煮或用水加热回流提取，合并煎液或提取液，部分浓缩，用盐酸调节pH值至1．0 2．0，80ħ保温，静置，用纱布过滤，冷冻干燥即得，临用前用蒸馏水配制成黄芩生药量25g/kg。

1．2动物Wistar大鼠，由河北省实验动物中心提供（合格证号码：006160），在自由摄食、饮水环境中适应3 4d后用于实验。

1．3试剂IMDM高糖干粉培养基美国Gibco-BRL（Gaithers-butg，MD）；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）天津TBD生物发展有限公司；胰蛋白酶（Trypsin）北京经科公司；脂多糖（LPS E．coli026：B6）美国Sigma（St．Louis，MO）；四甲基偶氮唑盐（MTT）美国Sigma（St．Louis，MO）；亚硝酸钠沈阳征信高科技研究所；硝普钠（SNP）北京刘李店福利化工厂。

1．4仪器5%CO2恒温培养箱：美国NUAIRE；空气净化操作台：苏净集团安泰公司；倒置显微镜：南京光学仪器厂；酶标仪：奥地利TECAN；重蒸水器：天津泰斯公司。

1．5方法大鼠6只，按公式计算给药剂量相当于25g/kg，给药前眼眶取血为0h血清（空白对照血清），然后按1ml/100g 灌胃给药，2h后再给药一次，分别于末次给药后0．5、1、2、3、4、5、6h眼眶取血0．3ml/只［1］。

血液室温放置1h，离心，无菌分离并混合血清，56ħ水浴中灭活30min，-20ħ冰箱冻存备用。

以IMDM培养液为基础，配制成内含10%小牛血清、100U青霉素和100U链霉素及50μmol/L2-巯基乙醇的细胞培养液。

小胶质细胞以约4ˑ105cells/ml的浓度在5%CO2，37ħ培养瓶中传代培养，选择第3 8代N9细胞进行实验。

取对数生长期的N9细胞，用新鲜的含10%小牛血清的IMDM培养液将细胞密度调至3ˑ105个/ml，接种于96孔板内，100μl/well，于37ħ，5%CO2的培养箱内培养，细胞贴壁培养12h后，换成无血清的新鲜培养液［2］。

稳定2h后，向N9细胞培养液中加入LPS（终浓度1μg/ml），之后加入不同时间点的黄芩含药血清样品，10μl/well，加药继续培养24h后，考察样品对LPS刺激的N9细胞NO、MDA、SOD及GSH释放量的影响。

以上实验每个时间点的血清设三个平行孔。

1．5．1细胞存活率检测（MTT法）［3］采用MTT法进行细胞存活率测定，操作时将细胞与0．25mg/ml MTT于37ħ下共同孵育4h，吸除培养液后加入等体积的DMSO，室温振荡10min，490nm测定其OD值。

1．5．2细胞外NO含量检测（Griess还原法）［4］采用Griess 还原法进行细胞外NO含量测定，检测时取50μl的上清培养液，转移到96孔细胞培养板，与50μl的Griess试剂（以蒸馏水配置的0．1%萘乙二胺，以5%磷酸配置1%对氨基苯磺酸，二86中药药理与临床2011；27（5）者以1：1等体积混合）室温下反应15min，540nm处测定其吸光度。

经实验室前期工作得出OD值与NO含量的线性关系为：NO浓度（μM）=OD值/0．0099。

1．5．3丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）含量检测参照试剂盒说明，测定MDA、SOD活力及GSH单位。

2结果2．1SBE含药血清对LPS刺激的N9细胞培养液内NO含量的影响细胞培养液中NO的含量检测结果显示：与空白对照组相比，LPS（1μg/ml）作用24h对大鼠皮层神经元的存活率没有明显影响；LPS（1μg/ml）作用24h可显著升高N9细胞培养液中NO的含量含量（造模成功）。

同时给予LPS（1μg/ml）及SBE不同时间点的大鼠含药血清，共同作用24h，实验结果表明：在不影响细胞的存活率的情况下，SBE0．5，1，2，3h的含药血清可以显著降低LPS刺激的N9细胞培养液中NO的含量，与模型对照组比较，差异显著；SBE4，5，6h的含药血清对LPS刺激的N9细胞培养液中NO的含量无明显影响，见表1。

表1SBE含药血清对LPS刺激的N9细胞培养液内NO含量的影响（珋xʃs，n=3）组别NO含量（μmol/L）细胞存活率（%）正常N9细胞6．89ʃ0．61100ʃ4．32模型组13．97ʃ0．5298．02ʃ5．100．5小时的含药血清13．04ʃ0．64*98．56ʃ5．121小时的含药血清9．98ʃ0．57＊＊96．25ʃ4．212小时的含药血清10．86ʃ0．39＊＊98．06ʃ4．123小时的含药血清11．13ʃ0．71*98．45ʃ4．464小时的含药血清13．24ʃ0．4897．14ʃ5．165小时的含药血清13．56ʃ0．8696．48ʃ4．566小时的含药血清14．02ʃ0．6797．25ʃ4．44与模型组比较*P＜0．05，＊＊P＜0．01（下同）2．2SBE含药血清对LPS刺激的N9细胞培养液内MDA含量的影响细胞培养液中MDA的含量检测结果显示：与空白对照组相比，LPS（1μg/ml）作用24h对大鼠皮层神经元的存活率没有明显影响；LPS（1μg/ml）作用24h可显著升高N9细胞培养液中MDA的含量含量（造模成功）。

同时给予LPS（1μg/ml）及SBE不同时间点的大鼠含药血清，共同作用24h，实验结果表明：在不影响细胞的存活率的情况下，SBE0．5，1，2，3h的含药血清可以显著降低LPS刺激的N9细胞培养液中MDA的含量，与模型对照组比较，差异显著；SBE4，5，6h的含药血清对LPS刺激的N9细胞培养液中MDA的含量无明显影响，见表2。

表2SBE含药血清对LPS刺激的N9细胞培养液内MDA含量的影响（珋xʃs，n=3）组别MDA含量（OD）细胞存活率（%）正常N9细胞0．1664ʃ0．018100ʃ4．89模型组0．2788ʃ0．03498．42ʃ6．330．5小时的含药血清0．2485ʃ0．04*98．78ʃ8．121小时的含药血清0．2145ʃ0．0345＊＊97．95ʃ5．752小时的含药血清0．1997ʃ0．019＊＊99．45ʃ5．123小时的含药血清0．2341ʃ0．034*97．56ʃ4．864小时的含药血清0．2745ʃ0．04296．87ʃ6．165小时的含药血清0．2756ʃ0．03996．12ʃ6．756小时的含药血清0．2812ʃ0．03197．87ʃ5．542．3SBE含药血清对LPS刺激的N9细胞培养液内SOD含量的影响细胞培养液中SOD的含量检测结果显示：与空白对照组相比，LPS（1μg/ml）作用24h对大鼠皮层神经元的存活率没有明显影响；LPS（1μg/ml）作用24h可显著降低N9细胞培养液中SOD的含量含量（造模成功）。