纳豆激酶分离纯化技术的研究
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第 22 卷 第 3 期 2008 年 9 月
山 东 轻 工 业 学 院 学 报 JOURNAL OF SHANDONG INSTITUTE OF LIGHT INDUSTRY
文章编号 :1004 - 4280 (2008) 03 - 0024 - 04
纳豆激酶分离纯化技术的研究
0 引言
纳豆激酶 (Nattokinase ,NK) 是日本学者须见洋 行从日本食品纳豆中纯化分离出的一种具有溶血栓 功能的丝氨酸蛋白酶 ,它是由枯草杆菌 ———纳豆菌 ( Bacillus natto) 发酵大豆后所产的酶[1] 。由于 NK 作 用迅速 ,维持时间长 ; 源于食品 ,安全性好 ; 分子量 小 ,是一个单链蛋白质 ,更易被人体消化道吸收 ;对 纤维蛋白的作用机制不同于尿激酶等现用于临床的 药物 ,它同其他纤溶酶一样直接作用于纤维蛋白 ,同
Phenyl Sepharose 疏水柱层析 Sephadex G2150 凝胶过滤层析 Sephadex G2100 凝胶过滤层板
第 22 卷
SDS - PAGE 测得 分子量ΠkDa
—
28 28 28 和 38
纯化倍数酶率活Π回%收
①4. 75 ②1. 32
—
①74. 3 ②77. 0
—
50
40
产品的生产主要是发酵液经过一系列的分离纯化方
具有操作简便 、可规模化生产及选择性强等特点 ,广 泛应用于规模化工业生产中 。基本工艺流程是离心 除菌 →盐析 (或有机溶剂沉淀) →超滤浓缩 →凝胶过 滤层析脱盐 →离子交换层析或疏水层析 。一般是将 凝胶层析 、疏水层析 、亲和层析和离子交换层析中两 种以上的层析方法配合使用来进行酶的分离 。
膨胀床吸附分离作为一种新型的蛋白质分离纯 化方法 ,其主要原理是根据静电吸附作用 ,将带有相 反电荷的蛋白酶吸附在离子交换柱上 。该分离方法 避免了柱层析分离过程中 ,因复杂的纯化步骤而导致 纳豆激酶失活的缺点 ,具有快速分离纯化的优点。胡 洪波等[17] 对膨胀床分离纳豆激酶过程的各个阶段进 行了考察 ,发酵液中经离心得上清液 ,将粗酶溶液的 pH 值调节至低于其等电点 ,采用 Streamline SP 强离子 交换吸附剂 ,Streamline 25 膨胀床柱 ,XK16 层析柱 ,吸 附时最佳的 pH 为 6. 0 ,电导率应低于 6. 2 msΠcm。然 后进行清洗解吸 ,得到比较纯的纳豆激酶 ,整个分离 过程缩短为 8～10 h ,回收率提高了约 50 %。
①超滤浓缩 —中空纤维式超滤器的优点是保留 体积小 ,单位体积中所含过滤面积大 ,可以逆洗 ,操 作压力较低 ,动力消耗较低 。缺点是料液需要预处 理 ;每个操作单元完成后需要认真清洗 ,还要注意防 腐 ;单根纤维损坏时 ,需调换整个模件 。 ②凝胶过滤 层析法 —又称排阻层析或分子筛方法 ,主要是根据 蛋白质的大小和形状 ,即蛋白质的质量进行分离和 纯化 。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构 物质 ,多是交联的聚糖 (如葡聚糖或琼脂糖) 类物质 , 使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分 离 。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载
3 新型的蛋白质分离纯化方法
3. 1 超顺磁性聚甲基丙烯酸甲酯 ( PMMA) 微球 超顺磁性聚甲基丙烯酸甲酯 ( PMMA) 微球是首
先通过喷雾悬浮聚合制备一定大小的磁性 PMMA 。 然后 ,与聚乙二醇的酯交换作用而强化其功能 ,获得 表面的氢氧基微球 ,用氯乙烯进行进一步的修饰来 转移表面的氨基修饰的磁性功能微球 。通过扫描电 镜和傅立叶转换红外线检测磁性微球的形态和表面 功能性 。一种亲和配基 - p - 氨基苄脒通过戊二醛 共价结合在氨基修饰的磁性微球上 。YANG Chen2 li ,等[16] 应用超顺磁性聚甲基丙烯酸甲酯 ( PMMA) 微 球从发酵液中直接纯化纳豆激酶 ,纯化因子与酶活 回收率分别为 8. 7 %和 85 % ,通过磁性微球从发酵 液中纯化纳豆激酶只需 400 min ,较传统纯化方法而 言 ,是一种快速的纯化方法 。 3. 2 膨胀床吸附
1. 2 发酵液的预处理 发酵液预处理的目的 ,在于改变发酵液的物理
特性 ,以利于固液分离 。发酵液中杂质很多 ,其中对 提取影响最大的是高价无机离子和杂蛋白等 。在采
体 ,不带电荷 ,吸附力弱 ,操作条件比较温和 ,可在相 当广的温度范围下进行 ,不需要有机溶剂 ,并且对分 离成分理化性质的保持有独到之处 。对于高分子物 质有很好的分离效果 。 ③离子交换色层分离法 —蛋
李炳锦 ,心除菌 ,硫酸铵去杂
朱健辉 ,等[10 ]
硫酸铵分级盐析
CM - Sepharose F. F. 柱层析
Sephadex G- 100 凝胶层析
Serine sepharose 2B 柱亲和层析 、 DEAE A - 50 柱阴离子交换层析和 Sephacryl S - 200 柱凝胶过滤层析
山 东 轻 工 业 学 院 学 报
研究者
前处理
黄俊 ,等[11 ]
硫酸铵盐析
熊晓辉 ,等[12 ] 慕娟 ,等[13 ] 许芳 ,等[14 ]
硫酸铵分级盐析 NaCl 浸提 ,硫酸铵盐析
硫酸铵分析盐析
续表 1
柱层析
①Sephadex G- 75 凝胶层析和 ②Sepharose CM Fast Flow 离子交换层析
Abstract :Besides absorption with advantage , nattokinase , potential as foodborne thrombolytic drugs , plays a vital role in thrombolysis in vitro and in vivo. The progress of separation and purification technology of nattoki2 nase was summarized , traditional column chromatography , novel separation technology ,such as superparamag2 netic poly (methyl methacrylate) beads 、expanded bed adsorption and reversed micelles extraction were dis2 cussed. Application of novel separation technology in separation nattokinase to advance its purity and output was put forward , which was of guiding significance in mass separation and purification production. Key words :nattokinase ; separation ; purification
用离子交换法提取时 ,高价无机离子的存在 ,会影响 离子交换剂对生化物质的交换容量 。杂蛋白的存
白质与离子交换剂的结合是通过蛋白质表面的电荷 与层析剂上离子基团之间的静电作用而结合 。在偏
在 ,不仅在采用离子交换法时会降低其吸附能力 ,而 且在常规过滤或膜过滤时 ,还会使滤速下降 ,膜受到 污染[3] 。因此 ,在预处理时 ,应尽量除去此类物质 。
Vol. 22 No. 3 Sep. 2008
史丰坤1 ,刘建军1 ,2 ,赵祥颖2
(1. 山东轻工业学院 食品与生物工程学院 ,山东 济南 250353 ; 2. 山东省食品发酵工业研究设计院 ,山东 济南 250013)
摘要 :纳豆激酶具有很强的体内外溶栓作用 ,并具口服吸收溶栓的优点 ,是一具有开发潜力的食源性溶栓药物 。对 纳豆激酶分离纯化技术的研究现状和发展趋势进行了综述 ,讨论了传统的柱层析与新型的超顺磁性聚甲基丙烯酸 甲酯 (PMMA) 微球 、膨胀床吸附和反胶团萃取等分离方法 ,提出了将新型分离技术应用于纳豆激酶的分离以提高其 纯度和产率 ,对大规模生产的分离纯化有一定的指导意义 。 关键词 :纳豆激酶 ;分离 ;纯化 中图分类号 :Q556 + . 9 文献标识码 :A
35
—
如上所述 ,传统柱层析分离方法在纳豆激酶分 离纯化中虽然得到了广泛应用 ,但是其纯化步骤多 , 时间长 ,操作工艺复杂 ,过程的总产率较低 ,这些步 骤多为间歇操作 ,生产效率难以提高 ,选择性低 ,从 而造成纳豆激酶的分离纯化的成本很高[15] 。探讨 适合于纳豆激酶分离纯化的工业化生产新方法是目 前研究的热点 。
2 传统的蛋白质分离纯化方法
离等电点的 pH 下 ,溶液中蛋白质以多价离子状态 存在 ,并为缓冲液中反离子所中和 。当样品进入离 交剂时 ,蛋白质被吸附 ,大量反离子被取代出来 ,这 样必定增加了溶液中的离子强度 , 同时 pH 升高 。 这样 ,离子交换的条件发生了变化 ,交换剂的吸附能 力被降低 。部分研究者对柱层析的研究成果见表
Sepharose CM Fast Flow 离子交换层析和 Superdex G- 75 凝胶层析
28 29 (单一条带 , 纯度 > 95 %)
— 19. 275 和 27. 101
27. 7
—
—
—
15. 6 10. 2
— 52. 9
32. 2 13. 2
50 75. 57
8. 4
49
—
—
26
纳豆激酶分离纯化技术的研究进展2续表1研究者前处?柱层析sdspage测得分子?kda纯化倍数酶活回收率黄俊等11硫酸铵盐析sephadexg75凝胶层析和sepharosecmfastflow离子交换层析475132743770熊晓辉等12硫酸铵分级盐析phenylsepharose疏水柱层析28慕娟等13nacl浸提硫酸铵盐析sephadexg2150凝胶过滤层析285040许芳等14硫酸铵分析盐析sephadexg2100凝胶过滤层板28和3835如上所述传统柱层析分离方法在纳豆激酶分离纯化中虽然得到了广泛应用但是其纯化步骤多时间长操作工艺复杂过程的总产率较低这些步骤多为间歇操作生产效率难以提高选择性低从而造成纳豆激酶的分离纯化的成本很高15
时可以激活体内的组织血纤溶酶原激活剂 (t2PA) ; 可以用细菌进行液体发酵生产 ,造价低廉等特点[2] , 可以预见 ,NK作为治疗血栓的药品的前景是十分广 阔的 。
纳豆激酶分离纯化的相关研究很多 ,绝大部分 采用的是传统的蛋白质分离纯化手段 ,交替使用沉 淀 、盐析 、离心 、过滤和色谱等技术 ,逐步除去杂质 , 但存在诸多缺点 。随着分离技术的不断发展 ,新型 分离技术在生物产品分离纯化中的应用已日益广 泛 ,将新型的分离技术应用于纳豆激酶分离纯化 ,对 理论研究及规模生产都有积极的指导意义 。
DEAE - Sepharose Fast Flow 阴离子层析 、 CM - Sepharose Fast Flow 阳离子层析和 Penpyl - Sepharose Cl - 4B 疏水层析柱
Butyl - Toyopea 柱层析
Superdex G- 75 凝胶过滤层析和 SP Sepharose Fast Flow 离子交换层析
柱层析是分离纯化蛋白质最常用的一种方法 , 1。
表 1 部分研究成果
研究者
前处理
柱层析
SDS - PAGE 测得 分子量ΠkDa
纯化倍数酶率活Π回%收
范强 ,等 [4 ] 王萍 ,等 [5 ]
白震 ,等 [6 ]
硫酸铵分级沉淀 生理盐水浸提 、 硫酸铵分级沉淀
生理盐水浸提 、 硫酸铵分级沉淀
刘柳 ,等[7] 离心除菌 ,硫酸铵去杂
收稿日期 :2008 - 05 - 14 作者简介 :史丰坤 (1982 - ) ,女 ,山东省东营市人 ,山东轻工业学院食品与生物工程学院在读硕士研究生 ,研究方向为微生物资源开发.
第3期
史丰坤 ,等 :纳豆激酶分离纯化技术的研究进展
25
1 纳豆激酶分纯特点及发酵液预处理
1. 1 纳豆激酶分离纯化的特点 纳豆激酶的分离纯化方法很多 ,当前纳豆激酶
Recent advances in separation and purification technology of nattokinase
SHI Feng - kun1 ,L IU Jian - jun1 ,2 ,ZHAO Xiang - ying2
(1. School of Food and Biology Engineering , Shandong Institute of Light Industry , Jinan 250353 , China ; 2. Shandong Food Ferment Industry Research & Design Institute , Jinan 250013 , China)
法后干燥制得 ,其酶的生产受纳豆杆菌的液体发酵 条件的限制 。发酶液是一个复杂的多相系统 ,含有 菌体 ,代谢物和未消耗培养基等成分 。分散在其中 的固体和胶状物质 ,具有可压缩性 ,粘度极大 ,属非 牛顿性液体 ,使得从发酵液中提纯酶很困难 。而且 被提取物通常不稳定 ,遇热 、极端 pH、有机溶剂都会 失活或分解 ,特别是蛋白质的生物活性与一些辅助 因子 、金属离子的存在和分子的空间构型有关 ,另外 由于提取物起始浓度较低 ,而最后成品要求达到较 高的纯度 ,加上杂质较多 ,因此常需多步操作 ,也需 要消耗较多的能量 。
山 东 轻 工 业 学 院 学 报 JOURNAL OF SHANDONG INSTITUTE OF LIGHT INDUSTRY
文章编号 :1004 - 4280 (2008) 03 - 0024 - 04
纳豆激酶分离纯化技术的研究
0 引言
纳豆激酶 (Nattokinase ,NK) 是日本学者须见洋 行从日本食品纳豆中纯化分离出的一种具有溶血栓 功能的丝氨酸蛋白酶 ,它是由枯草杆菌 ———纳豆菌 ( Bacillus natto) 发酵大豆后所产的酶[1] 。由于 NK 作 用迅速 ,维持时间长 ; 源于食品 ,安全性好 ; 分子量 小 ,是一个单链蛋白质 ,更易被人体消化道吸收 ;对 纤维蛋白的作用机制不同于尿激酶等现用于临床的 药物 ,它同其他纤溶酶一样直接作用于纤维蛋白 ,同
Phenyl Sepharose 疏水柱层析 Sephadex G2150 凝胶过滤层析 Sephadex G2100 凝胶过滤层板
第 22 卷
SDS - PAGE 测得 分子量ΠkDa
—
28 28 28 和 38
纯化倍数酶率活Π回%收
①4. 75 ②1. 32
—
①74. 3 ②77. 0
—
50
40
产品的生产主要是发酵液经过一系列的分离纯化方
具有操作简便 、可规模化生产及选择性强等特点 ,广 泛应用于规模化工业生产中 。基本工艺流程是离心 除菌 →盐析 (或有机溶剂沉淀) →超滤浓缩 →凝胶过 滤层析脱盐 →离子交换层析或疏水层析 。一般是将 凝胶层析 、疏水层析 、亲和层析和离子交换层析中两 种以上的层析方法配合使用来进行酶的分离 。
膨胀床吸附分离作为一种新型的蛋白质分离纯 化方法 ,其主要原理是根据静电吸附作用 ,将带有相 反电荷的蛋白酶吸附在离子交换柱上 。该分离方法 避免了柱层析分离过程中 ,因复杂的纯化步骤而导致 纳豆激酶失活的缺点 ,具有快速分离纯化的优点。胡 洪波等[17] 对膨胀床分离纳豆激酶过程的各个阶段进 行了考察 ,发酵液中经离心得上清液 ,将粗酶溶液的 pH 值调节至低于其等电点 ,采用 Streamline SP 强离子 交换吸附剂 ,Streamline 25 膨胀床柱 ,XK16 层析柱 ,吸 附时最佳的 pH 为 6. 0 ,电导率应低于 6. 2 msΠcm。然 后进行清洗解吸 ,得到比较纯的纳豆激酶 ,整个分离 过程缩短为 8～10 h ,回收率提高了约 50 %。
①超滤浓缩 —中空纤维式超滤器的优点是保留 体积小 ,单位体积中所含过滤面积大 ,可以逆洗 ,操 作压力较低 ,动力消耗较低 。缺点是料液需要预处 理 ;每个操作单元完成后需要认真清洗 ,还要注意防 腐 ;单根纤维损坏时 ,需调换整个模件 。 ②凝胶过滤 层析法 —又称排阻层析或分子筛方法 ,主要是根据 蛋白质的大小和形状 ,即蛋白质的质量进行分离和 纯化 。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构 物质 ,多是交联的聚糖 (如葡聚糖或琼脂糖) 类物质 , 使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分 离 。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载
3 新型的蛋白质分离纯化方法
3. 1 超顺磁性聚甲基丙烯酸甲酯 ( PMMA) 微球 超顺磁性聚甲基丙烯酸甲酯 ( PMMA) 微球是首
先通过喷雾悬浮聚合制备一定大小的磁性 PMMA 。 然后 ,与聚乙二醇的酯交换作用而强化其功能 ,获得 表面的氢氧基微球 ,用氯乙烯进行进一步的修饰来 转移表面的氨基修饰的磁性功能微球 。通过扫描电 镜和傅立叶转换红外线检测磁性微球的形态和表面 功能性 。一种亲和配基 - p - 氨基苄脒通过戊二醛 共价结合在氨基修饰的磁性微球上 。YANG Chen2 li ,等[16] 应用超顺磁性聚甲基丙烯酸甲酯 ( PMMA) 微 球从发酵液中直接纯化纳豆激酶 ,纯化因子与酶活 回收率分别为 8. 7 %和 85 % ,通过磁性微球从发酵 液中纯化纳豆激酶只需 400 min ,较传统纯化方法而 言 ,是一种快速的纯化方法 。 3. 2 膨胀床吸附
1. 2 发酵液的预处理 发酵液预处理的目的 ,在于改变发酵液的物理
特性 ,以利于固液分离 。发酵液中杂质很多 ,其中对 提取影响最大的是高价无机离子和杂蛋白等 。在采
体 ,不带电荷 ,吸附力弱 ,操作条件比较温和 ,可在相 当广的温度范围下进行 ,不需要有机溶剂 ,并且对分 离成分理化性质的保持有独到之处 。对于高分子物 质有很好的分离效果 。 ③离子交换色层分离法 —蛋
李炳锦 ,心除菌 ,硫酸铵去杂
朱健辉 ,等[10 ]
硫酸铵分级盐析
CM - Sepharose F. F. 柱层析
Sephadex G- 100 凝胶层析
Serine sepharose 2B 柱亲和层析 、 DEAE A - 50 柱阴离子交换层析和 Sephacryl S - 200 柱凝胶过滤层析
山 东 轻 工 业 学 院 学 报
研究者
前处理
黄俊 ,等[11 ]
硫酸铵盐析
熊晓辉 ,等[12 ] 慕娟 ,等[13 ] 许芳 ,等[14 ]
硫酸铵分级盐析 NaCl 浸提 ,硫酸铵盐析
硫酸铵分析盐析
续表 1
柱层析
①Sephadex G- 75 凝胶层析和 ②Sepharose CM Fast Flow 离子交换层析
Abstract :Besides absorption with advantage , nattokinase , potential as foodborne thrombolytic drugs , plays a vital role in thrombolysis in vitro and in vivo. The progress of separation and purification technology of nattoki2 nase was summarized , traditional column chromatography , novel separation technology ,such as superparamag2 netic poly (methyl methacrylate) beads 、expanded bed adsorption and reversed micelles extraction were dis2 cussed. Application of novel separation technology in separation nattokinase to advance its purity and output was put forward , which was of guiding significance in mass separation and purification production. Key words :nattokinase ; separation ; purification
用离子交换法提取时 ,高价无机离子的存在 ,会影响 离子交换剂对生化物质的交换容量 。杂蛋白的存
白质与离子交换剂的结合是通过蛋白质表面的电荷 与层析剂上离子基团之间的静电作用而结合 。在偏
在 ,不仅在采用离子交换法时会降低其吸附能力 ,而 且在常规过滤或膜过滤时 ,还会使滤速下降 ,膜受到 污染[3] 。因此 ,在预处理时 ,应尽量除去此类物质 。
Vol. 22 No. 3 Sep. 2008
史丰坤1 ,刘建军1 ,2 ,赵祥颖2
(1. 山东轻工业学院 食品与生物工程学院 ,山东 济南 250353 ; 2. 山东省食品发酵工业研究设计院 ,山东 济南 250013)
摘要 :纳豆激酶具有很强的体内外溶栓作用 ,并具口服吸收溶栓的优点 ,是一具有开发潜力的食源性溶栓药物 。对 纳豆激酶分离纯化技术的研究现状和发展趋势进行了综述 ,讨论了传统的柱层析与新型的超顺磁性聚甲基丙烯酸 甲酯 (PMMA) 微球 、膨胀床吸附和反胶团萃取等分离方法 ,提出了将新型分离技术应用于纳豆激酶的分离以提高其 纯度和产率 ,对大规模生产的分离纯化有一定的指导意义 。 关键词 :纳豆激酶 ;分离 ;纯化 中图分类号 :Q556 + . 9 文献标识码 :A
35
—
如上所述 ,传统柱层析分离方法在纳豆激酶分 离纯化中虽然得到了广泛应用 ,但是其纯化步骤多 , 时间长 ,操作工艺复杂 ,过程的总产率较低 ,这些步 骤多为间歇操作 ,生产效率难以提高 ,选择性低 ,从 而造成纳豆激酶的分离纯化的成本很高[15] 。探讨 适合于纳豆激酶分离纯化的工业化生产新方法是目 前研究的热点 。
2 传统的蛋白质分离纯化方法
离等电点的 pH 下 ,溶液中蛋白质以多价离子状态 存在 ,并为缓冲液中反离子所中和 。当样品进入离 交剂时 ,蛋白质被吸附 ,大量反离子被取代出来 ,这 样必定增加了溶液中的离子强度 , 同时 pH 升高 。 这样 ,离子交换的条件发生了变化 ,交换剂的吸附能 力被降低 。部分研究者对柱层析的研究成果见表
Sepharose CM Fast Flow 离子交换层析和 Superdex G- 75 凝胶层析
28 29 (单一条带 , 纯度 > 95 %)
— 19. 275 和 27. 101
27. 7
—
—
—
15. 6 10. 2
— 52. 9
32. 2 13. 2
50 75. 57
8. 4
49
—
—
26
纳豆激酶分离纯化技术的研究进展2续表1研究者前处?柱层析sdspage测得分子?kda纯化倍数酶活回收率黄俊等11硫酸铵盐析sephadexg75凝胶层析和sepharosecmfastflow离子交换层析475132743770熊晓辉等12硫酸铵分级盐析phenylsepharose疏水柱层析28慕娟等13nacl浸提硫酸铵盐析sephadexg2150凝胶过滤层析285040许芳等14硫酸铵分析盐析sephadexg2100凝胶过滤层板28和3835如上所述传统柱层析分离方法在纳豆激酶分离纯化中虽然得到了广泛应用但是其纯化步骤多时间长操作工艺复杂过程的总产率较低这些步骤多为间歇操作生产效率难以提高选择性低从而造成纳豆激酶的分离纯化的成本很高15
时可以激活体内的组织血纤溶酶原激活剂 (t2PA) ; 可以用细菌进行液体发酵生产 ,造价低廉等特点[2] , 可以预见 ,NK作为治疗血栓的药品的前景是十分广 阔的 。
纳豆激酶分离纯化的相关研究很多 ,绝大部分 采用的是传统的蛋白质分离纯化手段 ,交替使用沉 淀 、盐析 、离心 、过滤和色谱等技术 ,逐步除去杂质 , 但存在诸多缺点 。随着分离技术的不断发展 ,新型 分离技术在生物产品分离纯化中的应用已日益广 泛 ,将新型的分离技术应用于纳豆激酶分离纯化 ,对 理论研究及规模生产都有积极的指导意义 。
DEAE - Sepharose Fast Flow 阴离子层析 、 CM - Sepharose Fast Flow 阳离子层析和 Penpyl - Sepharose Cl - 4B 疏水层析柱
Butyl - Toyopea 柱层析
Superdex G- 75 凝胶过滤层析和 SP Sepharose Fast Flow 离子交换层析
柱层析是分离纯化蛋白质最常用的一种方法 , 1。
表 1 部分研究成果
研究者
前处理
柱层析
SDS - PAGE 测得 分子量ΠkDa
纯化倍数酶率活Π回%收
范强 ,等 [4 ] 王萍 ,等 [5 ]
白震 ,等 [6 ]
硫酸铵分级沉淀 生理盐水浸提 、 硫酸铵分级沉淀
生理盐水浸提 、 硫酸铵分级沉淀
刘柳 ,等[7] 离心除菌 ,硫酸铵去杂
收稿日期 :2008 - 05 - 14 作者简介 :史丰坤 (1982 - ) ,女 ,山东省东营市人 ,山东轻工业学院食品与生物工程学院在读硕士研究生 ,研究方向为微生物资源开发.
第3期
史丰坤 ,等 :纳豆激酶分离纯化技术的研究进展
25
1 纳豆激酶分纯特点及发酵液预处理
1. 1 纳豆激酶分离纯化的特点 纳豆激酶的分离纯化方法很多 ,当前纳豆激酶
Recent advances in separation and purification technology of nattokinase
SHI Feng - kun1 ,L IU Jian - jun1 ,2 ,ZHAO Xiang - ying2
(1. School of Food and Biology Engineering , Shandong Institute of Light Industry , Jinan 250353 , China ; 2. Shandong Food Ferment Industry Research & Design Institute , Jinan 250013 , China)
法后干燥制得 ,其酶的生产受纳豆杆菌的液体发酵 条件的限制 。发酶液是一个复杂的多相系统 ,含有 菌体 ,代谢物和未消耗培养基等成分 。分散在其中 的固体和胶状物质 ,具有可压缩性 ,粘度极大 ,属非 牛顿性液体 ,使得从发酵液中提纯酶很困难 。而且 被提取物通常不稳定 ,遇热 、极端 pH、有机溶剂都会 失活或分解 ,特别是蛋白质的生物活性与一些辅助 因子 、金属离子的存在和分子的空间构型有关 ,另外 由于提取物起始浓度较低 ,而最后成品要求达到较 高的纯度 ,加上杂质较多 ,因此常需多步操作 ,也需 要消耗较多的能量 。