酶联免疫吸附试验

4.实验方法
⑸加入底物： 每孔中先后加入TMB反应液A 50μL和TMB反应液 B 50 μL，室温放置显色。
⑹终止反应： 加入酶促反应终止液， 50μL/孔，终止反应。
未使用硫酸终止反应 使用硫酸终止反应
5.结果观察与判定
用酶标仪在450nm处测定各孔吸光度。用各标 准孔一抗浓度作为横坐标，其对应吸光值作为纵坐 标绘制标准曲线，最后利用标准曲线测得待检血清 中抗体的浓度。
一般特点影响因素应用分类ag与ab结合失去亲水性易受电解质作用发生凝集或沉淀反应鉴定病原微生物用已知ab检测未知ag诊断传染病用已知abag检测未知agab血清学反应经典的血清学反应免疫标记技术凝集反应补体结合反应中和反应沉淀反应酶免疫技术荧光免疫技术放射免疫技术其他免疫标记技术免疫标记技术是用标记物标记已知ag或ab进行的agab反应
3H、14C、32P、 57Gr、125I、131I
免疫分析测定
HRP、AP
免疫组化、免疫分 析测定
Luminol、 lucigenin
免疫分析测定
胶体金、铁蛋白
免疫组化、免疫分 析测定
二、酶免疫技术—ELISA
1.技术要点：
抗原或抗体的固相化 酶标记Ag或Ab
酶与酶作用底物
（1）固相载体
用。
2.实验原理
在固相载体（如聚苯乙烯反应板）上包被Ag 加入待测Ab（一抗） 加入相应的酶标记二抗 生成Ag-待测Ab-酶标记Ab的复合物， 再与该酶的底物反应生成有色产物， 酶标仪测定OD值，计算抗体的含量（待测抗体的量
与有色产物成正比）
间接法ELISA原理
3.实验材料
可与Ag(Ab)等大分子蛋白结合 结合容量高，结合稳定 生物大分子固化后仍保持活性 固化方法简便易行，快捷经济
（2）酶标记Ab或Ag
基本要求： 酶标记Ag：纯度要高，抗原性完整； 酶标记Ab：特异性好，效价高，亲和力
强，比活性高以及易于批量生 产和分离纯化
（3）酶与酶作用底物
2）若要用PBS将2mg/mL的标准品进行等差稀释为五 种浓度（1mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、 0.4mg/mL、0.2mg/mL），如何操作？请列表说明。
TMB 蓝色
-
联苯胺
致癌 + -
2.ELISA的基本原理
固相Ag/Ab的形成（包被） Ag-Ab反应 酶促显色反应
3.ELISA的类型
直接法(direct ELISA) 间接法(indirect ELISA) 夹心法(sandwich ELISA) 竞争法(competitive ELISA) 捕获法(capture ELISA) 生物素-亲和素系统ELISA法(BAS-ELISA)
酶活性高 标记后酶活性稳定，且不影响标记Ag与Ab的
免疫反应性 酶催化底物后信号易判定或测定 酶活性不受样品中其他成分的影响 酶、辅助因子及底物理化性质稳定、安全无害、
廉价
常用酶及其底物
辣根过氧化物酶(HRP)
常用底物：
名称
简写 显色
避光
邻苯二胺 OPD 橙黄色 +
四甲基
制作标准曲线
编号
AB
C
D
E
Leabharlann Baidu
一抗稀释倍数 4000 8000 16000 32000 64000
一抗稀释液浓度 (ug/mL，横轴) 0.5
A450 (纵轴)
原始数据 均值
0.25
0.125 0.0625 0.03125
测定结果
待测血清
1
2
A450(纵轴)
原始数据 均值
浓度
6.注意事项
加样时应加到板孔的底部，避免加至孔壁上部，并 注意不能溅出或产生气泡。
4.实验方法
标 准 品
待测血清1 待测血清2
空白组
4.实验方法
⑴包被抗原（已做）： 用包被液将抗原作适当稀释（10μg/mL），加入96 孔酶标反应板中，100μL/孔，4℃过夜。 洗涤：
倒尽板孔中液体，加洗涤液200μL/孔，轻摇 半分钟，最后将反应板倒置在吸水纸上，将孔中 洗涤液拍干，反复三次 。
三、ELISA—间接法
1.实验目的 2.实验原理 3.实验材料 4.实验方法 5.结果观察与判定 6.注意事项
1.实验目的
掌握酶联免疫吸附试验间接法的原理、方法、 结果判定及临床应用。
掌握酶标仪的正确使用方法。 复习微量移液器的正确使用方法。 熟悉酶联免疫吸附试验的分类、原理及主要应
⑷ 沉淀反应
中和反应
补体结合反应
免疫标记技术
酶免疫技术 荧光免疫技术 放射免疫技术 其他免疫标记技术
2. 免疫标记技术
免疫标记技术是用标记物标记已知Ag（或Ab）进行 的Ag、Ab反应。
通过检测标记物来反映Ag、Ab反应的情况，从而间 接地测出被检Ag或Ab的存在与否或量的多少。
常用的标记物有荧光素、酶、放射性核素及胶体金 等。
一、血清学反应和免疫标记技术
1. 血清学反应，即Ag和Ab在体外进行的特异性 结合反应。 ⑴一般特点 ⑵影响因素 ⑶应用 ⑷分类
⑴血清学反应的一般特点
特异性 可逆性 比例性 阶段性
⑵血清学反应的影响因素
电解质：
Ag与Ab结合失去亲水性，易受电解质作用发生凝集或 沉淀反应
温度：
⑵封闭（1%BSA）： 200μL/孔，37℃孵育1h，或4℃过夜。 洗涤3次
4.实验方法
⑶加入一抗： 将抗核抗体标准品（标准孔，倍比稀释）和待检血 清作为一抗分别加入酶标反应板孔中，100μL/孔， 37℃孵育30min。同时用PBS做空白组。 洗涤3次
⑷加入HRP-羊抗人IgG（二抗）： 将稀释的HRP-羊抗人IgG加入酶标反应板，100μL/ 孔，37℃孵育0.5小时。 洗涤6-7次
温育时板上应加盖或膜以防液体蒸发。 洗涤是决定实验成败关键的步骤，一定严格按要求
洗涤。 洗板时孔内液体拍得越干净洗涤效果更好。 TMB经HRP作用15min后显色完全。终止显色反应
后，应在10min内测定A450nm。
7.思考题
1）若要对传染病进行早期诊断，宜采用ELISA的哪 种方法？为什么？简述其原理及基本流程。
抗原：DNA纯品 一抗：抗核抗体标准品、待检血清 酶标二抗：辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG 底物溶液：TMB溶液（A液 + B液） 包被液：0.05mol/L 碳酸盐缓冲液，pH9.6 封闭液：BSA（小牛血清白蛋白），pH7.4 洗涤液：Tris-HCl tween-20，pH7.4 酶促反应终止液：2mol/L H2SO4溶液
温度升高加速反应，常用37℃、4℃
酸碱度：
通常pH6~8
⑶血清学反应的应用
用已知Ag(Ab)检测未知Ab(Ag)
例如： 鉴定病原微生物
——用已知Ab检测未知Ag
诊断传染病
——用已知Ab(Ag)检测未知Ag(Ab)
(4)血清学反应的分类
血清学反应
凝集反应
经典的血清学反应
免疫标记技术
免疫标记技术 = 免疫技术 + 标记技术
Ag、Ab反应 示踪物质标记
高度特异性 高度灵敏性 应用：
对微量的Ag（或Ab）进行定性、定量及
定位检测。
常用免疫标记物质
类别 荧光素 放射性核素 酶 化学发光物 金属颗粒
标记物
用途
FITC、RB200、 TRITC、镧系元素 螯合物
免疫组化、免疫分 析测定