PCR技术在临床检验中的应用

统计学计算 得出结论
应用PCR 反应的对 DNA进行 几何级数 放大
AF S M AF S M AF S M AF S M
CSF
D13S796
D16S3391 GAB
STR分型银染分析结果
组织配型技术的 实验诊断进展
概述
器官移植（organ transplantation ）
由于不同种族、不同个体的HLA型别千差万别，必须 采用一定的方法对捐献者和患者的HLA型别进行确定，从 而选择与患者HLA相配合的捐献者进行移植，这是器官移 植治疗成功的关键。
寄生虫 等
PCR及其相关技术在遗传性疾病诊断中的应用
镰形细胞贫血
由于基因突变而引起Hb的结构异常，正常人Hb的β珠 蛋白链第6位上谷氨酸被缬氨酸代替而形成血红蛋白S(HbS) 所致。
Chehab等设计一对引物，扩增后正常人有2个片段， 镰形细胞贫血的纯合子，仅有一个片段；杂合子有3个片段。
杜氏营养不良症（DMD）
Monitoring Real-Time PCR
Three Phases of PCR
平台期 线性扩增期
指数扩增期
❖ 相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性。
实时荧光定量PCR原理
❖Ct值与起始模板的关系 ：每个模板的Ct值与该模板 的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多 ，Ct值越小。
❖癌基因、抗癌基因缺失与点突变研究 ❖肿瘤相关病毒基因的研究： HBV与原发性肝癌；
EBV与鼻咽癌、何杰金氏病等有关；近年来用PCR技 术在宫颈癌、前列腺癌、肠癌和Kaposi肉瘤等组织中 均检出有HCMV DNA顺序，提示 HCMV具有潜在的致 癌性。
法医学研究
利用罪犯在犯罪现场留下的任何少量标本， 如一根毛发、一滴血液、极小的血斑和精斑等其 它分泌物或组织块等进行PCR扩增，结合指纹图 谱等分析可进行个体识别、亲子鉴定、性别鉴定 等。
Used to Calculate CT
0.023 ng/ µL
样品扩增图
CT = 23.35
CT = 28.01
CT = 30.85
样本未检测到DNA
PCR技术在医学上的应用
❖ 病原体的检测 ❖ 基因遗传病的诊断 ❖ 肿瘤基因的检测和诊断 ❖ 法医学研究
病原体的检测
❖ 人类免疫缺陷病毒（HIV） ❖ 乙肝病毒(HBV)及其分型 ❖ 丙肝病毒（HCV）与戊肝病毒（HEV） ❖ 人乳头瘤病毒（HPV） 及其分型 ❖ 结核杆菌 ❖ 巨细胞病毒 ❖ EB病毒 ❖ 幽门螺杆菌 ❖ 其它病原微生物:脑膜炎双球菌、淋球菌、肺炎支原体、
TaqMan®探针
R
Q
5
3
Target sequC® 染料) Q = 淬灭荧光 (NFQ)
Taqman荧光定量PCR技术
正向链引物
R
5’
Q
3’
5’
探针杂交
5’
3’ 5’
反向链引物
Taqman荧光定量PCR技术
hv
Excitation
正向链引物
R
5’
60％的DMD患者存在着dystrophin基因缺失
甲型血友病 为X性连锁隐性遗传
另外，一些有遗传倾向的疾病，尤其是老年性疾病， 如糖尿病、高血压等
肿瘤基因的检测和诊断
❖ 恶性肿瘤分子标记的检测：如慢性粒细胞性白血病
(CML）。CML的费城染色体(即ph染色体）是标记染色体; 融合基 因BCR-ABL的检测
HLA – “人类白细胞抗原”
抗 原
HLA基因是调节人体免疫反应 和异体移植排斥作用的一组基
基
因
因
HLA系统的基因位于第六号染 色体的短臂上。HLA抗原根据 不同的基因位点分为一类、二 类和三类抗原
一类抗原: HLA－A，B，C 位点 二类抗原：HLA－DR，DQ，DP 位点 三类抗原：补体
36
34
32
30
CT
28
26
24
22
20 0.001
Sample
y = -1.2908Ln(x) + 27.187 R2 = 0.997
0.010
0.100
1.000
(Log N) initial concentration
10.000
100.000
DNA标准品扩增图
50 ng/ µL
Smaller the CT number the more DNA detected
存在部位
重复单位 长度 重复次数 总序列长 度 重复单位 的差异
存在数量
微卫星DNA 染色体任何部位
12－-6b6pbp
10－60次 约200bp
小卫星DNA
染色体近端粒和着 丝粒区 6－70bp，常富含 GC 几次到几百次 0.5－30kb
重复单位的变异性 低，可看成 结构相同
很多，整个人基因组 5－10万
Threshold – 即能够检测到的荧光信号域值，通过比较不
同样品达到域值所需的循环数，从而可以比较不同样品的 浓度。
CT (Cycle Threshold) -在荧光定量PCR技术中，有一
个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表 threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到 达设定的域值时所经历的循环数。
定量与常规的差别
❖ 常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析。
❖ 定量PCR技术： 对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量及
定性分析。
实时荧光定量PCR原理
❖ 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系 中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测 整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板 进行定量分析的方法。
Q
3’
5’
退火，延伸
5’
3’ 5’
反向链引物
Taqman荧光定量PCR技术
hv
Excitation
R
5’
Q
3’
5’
5’
3’
5’
替换
Taqman荧光定量PCR技术
R
5’
Q
3’
5’
5’
3’
5’
剪切
Taqman荧光定量PCR技术
R
5’
3’
5’
5’
3’
5’
延伸结束
PCR Amplification Plot
STR（short tandem repeat）
❖ 短串联重复序列 ，也叫微卫星DNA，是一类广 泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序 列。其核心序列为2-6bp，重复次数通常在1530次。 DNA片段长度为100-350bp。它们也是 染色体上的来自父母的配对的等位基因。
小卫星与微卫星DNA的区别
群体遗传学特征：无法判断各靶基因座位基因型，因此 不能按照传统遗传学方法调查人群中等位基因数和分析 等位基因的频率。
不同的个体有不同的DNA指纹图
DNA指纹图技术存在的缺点
无法确定等位基因。 对任何一条带，无法确定是由纯合子或杂合子产 生。 无法确定每条带所代表的基因座即染色体定位。 无法确定基因座之间的独立性。 对检材要求较高。
Threshold
FAM™ Dye signal from sample
CT value = 23.35
Smaller the CT number the more DNA detected
VIC™ Dye signal from IPC
CT value = 28.06
定量结果
ng/µL
由标准曲线计算样品量
❖ 在细胞膜上能检测出的抗原特异性，则称为表现型 (Phenotype)，如：A1，A11，B8，B55，DR17，DR7。
组中分布极为广泛，且片段小，等位基因多，杂合度高。 ❖ 如两个无关个体在14个STR基因座基因型完全相同的可能性
仅为1×10-14，理论上讲目前地球上60亿人口中没有任何两 无关个体在这14个STR基因座基因型完全相同。
获得检材 中细胞
经物理 化学作 用释放
DNA
经过一系列实验操作及
分泌物
仪器分析得到分型结果
1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻 1989年为PCR爆炸年
1993年Mullis荣获诺贝尔化学奖
Wxd-1.pdf
PCR技术的分类
❖ 免疫PCR（Immuno－PCR，I-PCR） ❖套式引物PCR（Nested primer PCR） ❖反转录 PCR（Reverse transcription PCR，
STR技术在 临床检验中的应用
DNA指纹技术（DNA Profile）
人类基因组超过90％的序列为重复序列，它 们不编码mRNA前体或其它RNA，由串联、重复 排列而成的DNA序列构成数量可变的串联重复序 列，其串联重复单位的数目在人群中存在较大差 异 性 ， 具 有 高 度 多 态 性 。 重 复 单 位 长 度 为 10 － 70bp的称为小卫星DNA.
重复单位组成稍有 差异，如单个碱基 置换
有限，有些染色体 尚未见到
由于每个人STR基因座的核心单位重复次数不同， 造成它们的DNA片段长度不同，因此构成了人群中极 为高度的STR基因座的DNA片段长度的多态性。 多数STR基因座具有多态性，其高度多态性主要 源于核心序列重复次数的个体间差异，这种差异在基 因传递的过程中一般遵循孟德尔共显性遗传规律。
约40％
假基因
基因片段
内含子，非翻 译序列
串联重复序列/ 成簇重复序列
散在重复序列
人类基因组的组织成分
DNA指纹技术基本流程图
DNA指纹图的遗传规律
遗传方式：子代图谱中所有的片段都可以在双亲的图谱 中找到，片段的传递符合孟德尔遗传规律。
个体的组织同一性：即来源于身体不同部位与类型的组 织，其DNA指纹图谱是一致的。
❖ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中 横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。
❖ 因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上 计算出该样品的起始拷贝数。
荧光定量标准曲线
实时荧光定量PCR原理
❖荧光化学 ： ❖ 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：
荧光探针和荧光染料。
Taqman荧光定量PCR技术
HLA – “人类白细胞抗原”
HLA, 英文全称 Human Leucocyte Antigen。 HLA作为人体组织细胞的遗传学标志，在机体的抗原
识别、提呈、免疫应答调控以及抗感染免疫等方面发挥 重要作用。 HLA是导致移植物排斥的主要抗原，HLA配型是影响器 官移植存活率的重要因素之一。长期以来人类白细胞抗 原(HLA)又被称为移植抗原。
细胞核基因组 ＝3200Mb
约10％
约90％
基因和基因 有关序列
专一或中等 重复
基因外DNA
＜10％
90％＞
编码DNA
非编码DNA
人类基因组
线粒体基因组 ＝16.6kb
2个rRNA基 因
70～80％
22个rRNA 基因
20％～30％
13个蛋白 编码基因
专一的或低 拷贝数序列
中度至高度重复序列
约60％
PCR技术 STR技术 组织配型技术
测序技术
在临床检验的应用进 展
PCR技术在 临床检验中的应用
PCR技术简史：
1983年，提出了PCR的概念
1985年，Mullis等提出了耐热DNA聚 合酶的应用使得PCR能高效率的进 行，随后PE-Cetus公司推出了第一 台PCR自动化热循环仪
1988年在《Science》上发表了关于 TaqDNA聚合酶的论文
STR分析个体基因型原理
引物
AATG AATG AATG
7 repeats
引物
引物
引物
8 repeats
重复单位的不同决定了个体之间的特异性
纯合子 = 双等位基因等长 杂合子 = 双等位基因不等长
优点： ❖ 仅需少量模板DNA，灵敏度、扩增效率高。 ❖ 第二代法医DNA指纹技术的核心 ❖ 个体识别率高 ❖ STR检测和以往的DNA水平的检测相比，由于它在人类基因
HLA的多态性及其遗传规律
❖ 正常情况下，人体细胞是二倍体型的。染色体上HLA各位点 的等位基因全部为共显性的。
❖ 由于在一条染色体上HLA各位点之间距离非常近，因此HLA 常作为一个整体遗传给子代。
❖ 在 一 条 染 色 体 上 HLA 各 位 点 的 基 因 组 合 称 HLA 单 倍 体 型 (Haplotype)，如：A1，B8，DR17。
RT-PCR） ❖反向PCR（Reverse PCR） ❖标记PCR（Labelled primers PCR） ❖不对称PCR（Asymmetric PCR） ❖ 玻片PCR（Slide—PCR） ❖ 定量PCR ❖锚定PCR（Anchored PCR）
实时荧光定量PCR
1996年由美国Applied Biosystems公司 推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到 定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有 特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动 化程度高等特点，目前已得到广泛应用。