基因工程-第八章1
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• 启动子 • 终止子 • 增强子 • 密码子 • 质粒拷贝数
• 结构基因
启动区 核糖体识别区 ATG ORF TAG 终止区
2.1 启动子
• 启动子（Promoter）是DNA上的能与RNA聚合酶结合并 能起始mRNA合成的序列。
• 强启动子起始合成mRNA的效率高，弱启动子合成的效率 低。
• 启动子序列：大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺 序（consensus sequence）： -35 Box 和 -10 Box
• 感染寄生缺陷型 防止重组细菌/病毒扩散污染，生物武器除外
• 具有较高的转化效率 较高的可转化性
• 具有与载体选择标记互补的表型 利于筛选
各种基因工程受体的特性
大肠杆菌
• 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单， 重组子稳定。
• 产结构复杂、种类繁多的内毒素。 • 适用于外源DNA的克隆扩增和扩增、原核生物基因的高效
肽链的合成后加工与修饰
• 一级结构的加工修饰
1）N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除：N端甲酰蛋氨酸是多肽链合 成的起始氨基酸，必须在多肽链折迭成一定的空间结构之前被 切除。其过程是：① 去甲酰化；② 去蛋氨酰基。
2）氨基酸的修饰：由专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、 羟基化、磷酸化、甲酰化等。
3）二硫键的形成：由专一性的氧化酶催化，将-SH氧化为-S-S-。 4）肽段的切除：由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除。
• 与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖 基化修饰系统；
• 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生 产；
• DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体； • 细胞培养条件苛刻，生长缓慢。
各种基因工程受体的特性
植物细胞（拟南芥菜、烟叶）
• 农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，培养 简单且成本低廉，具有光合作用，适用于高等植物基因表 达调控的研究、农作物品质的改良。
• 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备。 • 人β干扰素、白介素等。
各种基因工程受体的特性
链霉菌
• 抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产 内毒素，主要用于抗生素生产菌株的改良。
• 遗传不稳定，生长相对缓慢。
各种基因工程受体的特性
酵母
• 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单； • 外源基因表达系统完善，遗传稳定； • 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统； • 内源性蛋白产物种类繁多且含量高； • 适用于外源DNA的克隆、扩增以及真核生物基因的高效表达、
启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性
• 野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一
起，在没有诱导物存在时，整个操纵 子处于基基底水平转录底水平表达；
• 诱导物可以使启动子Plac介导的转录
大幅提高。
启动子的可控性
色氨酸启动子Ptrp的可控性
• 色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复
合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养 系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯 酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制 作用。 • 在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸 是困难的，因此基因工程中往往添加
•原核细胞多肽链合成的起始
• 核糖体30S小亚基附着于mRNA起始信号部位：原核生物mRNA都具有核糖体 结合位点(SD序列)，位于AUG上游8-13个核苷酸处。 SD序列与30S小亚基中 的16S rRNA3’端一部分序列互补，核糖体能选择mRNA上AUG的正确位置来 起始肽链的合成，该结合反应由起始因子3（IF-3）介导。
•翻译的终止及多肽链的释放
• 无论原核生物还是真核生物都有三种终止密码子UAG、UAA 和UGA。
• 没有一个tRNA能够与终止密码子作用，而是靠特殊的蛋白质 因子促成终止作用。
• 这类蛋白质因子叫做释放因子，原核生物有三种释放因子： RF1、RF2和RF3。RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA和 UGA，RF3的作用还不明确。真核生物中只有一种释放因子 eRF，它可以识别三种终止密码子。
• 遗传操作繁琐。
第二节 外源基因在大肠杆菌中的表达
1. 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 2. 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 3. 外源基因在大肠杆菌中表达形式 4. 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
1. 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌特征
原核生物基因表达特点
• 只有一种RNA聚合酶：识别原核细胞启动子，催化所有 RNA合成。
• 以操纵子为单位：数个相关结构基因与其调控区结合形成 一个表达的协同单位。
• 转录和翻译偶联、连续进行。
原核生物基因表达特点
• 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。 • 调控主要在转录水平上。 • mRNA的核糖体结合位点（rbs, SD）
Shine-Dalgarno（S-D）sequence： mRNA中用于结合原核生物核糖体 的序列。SD序列在mRNA起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处，富含嘌呤 的碱基序列，能与细菌16SrRNA的3’端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。
第八章 外源基因表达系统
• 基因表达
遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程 ——中心法则。
• 克隆基因的表达
外源基因在宿主细胞（原核细胞或真核细胞） 中的表达。
核糖体：合成蛋白质的“工厂” 核糖体由两个亚基构成
原核生物核糖体
真核生物核糖体
30S亚基
50S亚基
40S亚基
60S亚基
21种蛋白质 16SrRNA 34种蛋白
• PL启动子：来自 λ 噬菌体早期左向转录启动子，活性比Trp启动子高
11倍左右。 受控于温度敏感的阻遏物 cIts857。在低温(30℃)时， cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高温(45℃)时，cIts857蛋白失 活，阻遏解除，促使PL启动子转录。
• T7噬菌体启动子：来自 T7 噬菌体的启动子，具有高度的特异性，
➢ 信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子（SRP）识别并特异结 合，然后再通过SRP与膜上的对接蛋白（DP）识别并结合 后，将所携带的蛋白质送出细胞。
第一节 基因工程受体细胞
• 限制性缺陷型 避免修饰和降解
外切酶和内切酶活性缺陷（recB-/recC-/hsdR-）
• 重组整合缺陷型 避免重组整合
用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）
• Plac、Ptrp、 Ptac 、PL、 T7等。
• Lac启动子：乳糖操纵子，受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控
。负调控是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白。乳糖及某些类似物如IPTG可 与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这 种阻遏，诱导转录发生。
• trp启动子：色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。
基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究； • DNA重组实验和基因工程重要的真核受体细胞。
各种基因工程受体的特性
昆虫细胞
• 具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对 较快，培养成本低廉，遗传稳定；
• 适用于真核生物基因的高效表达； • DNA重组操作系统欠完善。
各种基因工程受体的特性
哺乳动物细胞（CHO、Hela）
表达、基因文库的构建。 • DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。 • 人胰岛素、生长激素、干扰素等。
各种基因工程受体的特性
枯草（芽孢）杆菌
• 遗传背景清楚，具有胞外酶分泌-调节基因，蛋白质分泌 机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素。
• 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有 效分泌。
氨基酸的活化
• 氨基酸的活化以及活化氨基酸与tRNA的结合，均由氨基酰 tRNA合成酶催化完成。
• 原核细胞中起始氨基酸活化后，还要甲酰化，形成甲酰甲硫 氨酸tRNA( fMet-tRNAfMet )。真核细胞没有此过程。
• 真核生物中与Met结合的tRNA有两种，Met-tRNAimet是具 有起始功能的，与Met结合后，可以在mRNA的AUG处就位， 参与形成翻译的起始复合物; Met-tRNAmet参与肽链延长， 它与Met结合，必要时进入核糖体，为延长中的肽链添加 Met 。
•原核细胞多肽链合成的起始
• 30S前起始复合物的形成：在起始因子2作用下，甲酰蛋氨酰起始tRNA与 AUG相结合，即密码子与反密码子配对，IF3从三元复合物中脱落，形成30S 前起始复合物。
• 70S起始复合物的形成：50S亚基与30S前起始复合物结合，IF2脱落，形成70S 起始复合物。此时fMet-tRNAfmet占据着50S亚基的肽酰位。而A位则空着有 待于对应mRNA中第二个密码的相应氨基酰tRNA进入，从而进入延长阶段。
5SrRNA
23SRNA 30多种蛋白质 18SrRNA 50多种种蛋白 5SrRNA
28SRNA
蛋白质生物合成
• 蛋白质生物合成可分为五个阶段，氨基酸的活化、多肽链合成 的起始、延长、终止和释放、蛋白质合成后的加工修饰。
• 蛋白质生物合成需核糖体、mRNA、tRNA、氨酰转移核糖核 酸 (氨酰tRNA)合成酶、可溶性蛋白因子等大约200多种生物大 分子同作用来完成。
大肠杆菌特征
大肠杆菌表达外源基因的劣势：
• 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能--无特异性空间构象的多肽链 • 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统--糖基化和磷酸化等 • 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白-- 表达产物不稳定 • 细胞周质内含有种类繁多的内毒素--人体热原反应
2. 外源基因在大肠杆菌 中高效表达原理
•真核细胞蛋白质合成的起始
真核细胞蛋白质合成起始复合物的形成中需要更多的起始因子 参与，因此起始过程也更复杂。
1）起始甲硫氨酸不需甲酰化 2）已发现的真核起始因子有近10种 3）真核mRNA没有SD序列，但5‘端帽子结构与其在核蛋白体就
位相关。帽结合蛋白（CBP）可与mRNA帽子结合，促进 mRNA与小亚基结合。
• 大肠杆菌大多数启动子与所属基因转录起始 位点之间的距离为6-9个碱基
启动子
基因工程常用的原核启动子（最佳启动子必须具备 的条件）：
• 强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%30%以上。 • 应呈现低水平的基础转录，便于表达毒性蛋白等。 • 应是可诱导型的，用温度或化学试剂诱导。
IAA诱导Ptrp介导的目基因的表达。
核糖体结合位点（RBS）
• 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于 转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的 翻译起始效率密切相关。
• mRNA翻译的起始效率主要由其5' 端的结构序列所 决定，称为核糖体结合位点（RBS）。
只有 T7 RNA聚合酶才能使其启动。效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍 左右。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶。
启动子的可控性
• 外源基因的全程高效表达往往会对大肠杆菌的生理生化过 程造成不利影响；
• 通过可控性的启动子调整外源基因表达的时序，即通过启 动子活性的定时诱导，将外源基因的转录控制在受体细胞 生长的某一特定阶段。
肽链的合成后加工与修饰
• 高级结构的形成
1）构象的形成：在分子内伴侣、辅助酶及分子伴侣的协 助下，形成特定的空间构象。
2）亚基的聚合 3）辅基的连接
肽链的合成后加工与修饰
• 信号肽
➢ 分泌蛋白质及细胞膜蛋白质等，以前体物质多肽的形式合 成，其N末端含有作为通过膜时之信号的氨基酸序列，这 种氨基酸序列称信号肽或信号序列 ，由约15-25个氨基酸 所组成。
当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。 3-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活 性，促使trp启动子转录。
• Tac启动子：由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏
蛋白的Biblioteka Baidu调节，它的启动能力比Lac和trp都强。Tac启动子受IPTG的诱 导。
原核表达系统注意事项
①外源基因不能带有内含子 ② 必须用cDNA ③ 不能直接用真核基因组DNA ④ 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等） ⑤ 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害
大肠杆菌特征
大肠杆菌表达外源基因的优势：
• 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 • 基因克隆表达系统成熟完善 • 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 • 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
• 结构基因
启动区 核糖体识别区 ATG ORF TAG 终止区
2.1 启动子
• 启动子（Promoter）是DNA上的能与RNA聚合酶结合并 能起始mRNA合成的序列。
• 强启动子起始合成mRNA的效率高，弱启动子合成的效率 低。
• 启动子序列：大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺 序（consensus sequence）： -35 Box 和 -10 Box
• 感染寄生缺陷型 防止重组细菌/病毒扩散污染，生物武器除外
• 具有较高的转化效率 较高的可转化性
• 具有与载体选择标记互补的表型 利于筛选
各种基因工程受体的特性
大肠杆菌
• 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单， 重组子稳定。
• 产结构复杂、种类繁多的内毒素。 • 适用于外源DNA的克隆扩增和扩增、原核生物基因的高效
肽链的合成后加工与修饰
• 一级结构的加工修饰
1）N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除：N端甲酰蛋氨酸是多肽链合 成的起始氨基酸，必须在多肽链折迭成一定的空间结构之前被 切除。其过程是：① 去甲酰化；② 去蛋氨酰基。
2）氨基酸的修饰：由专一性的酶催化进行修饰，包括糖基化、 羟基化、磷酸化、甲酰化等。
3）二硫键的形成：由专一性的氧化酶催化，将-SH氧化为-S-S-。 4）肽段的切除：由专一性的蛋白酶催化，将部分肽段切除。
• 与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖 基化修饰系统；
• 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生 产；
• DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体； • 细胞培养条件苛刻，生长缓慢。
各种基因工程受体的特性
植物细胞（拟南芥菜、烟叶）
• 农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，培养 简单且成本低廉，具有光合作用，适用于高等植物基因表 达调控的研究、农作物品质的改良。
• 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备。 • 人β干扰素、白介素等。
各种基因工程受体的特性
链霉菌
• 抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产 内毒素，主要用于抗生素生产菌株的改良。
• 遗传不稳定，生长相对缓慢。
各种基因工程受体的特性
酵母
• 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单； • 外源基因表达系统完善，遗传稳定； • 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统； • 内源性蛋白产物种类繁多且含量高； • 适用于外源DNA的克隆、扩增以及真核生物基因的高效表达、
启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性
• 野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一
起，在没有诱导物存在时，整个操纵 子处于基基底水平转录底水平表达；
• 诱导物可以使启动子Plac介导的转录
大幅提高。
启动子的可控性
色氨酸启动子Ptrp的可控性
• 色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复
合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养 系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯 酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制 作用。 • 在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸 是困难的，因此基因工程中往往添加
•原核细胞多肽链合成的起始
• 核糖体30S小亚基附着于mRNA起始信号部位：原核生物mRNA都具有核糖体 结合位点(SD序列)，位于AUG上游8-13个核苷酸处。 SD序列与30S小亚基中 的16S rRNA3’端一部分序列互补，核糖体能选择mRNA上AUG的正确位置来 起始肽链的合成，该结合反应由起始因子3（IF-3）介导。
•翻译的终止及多肽链的释放
• 无论原核生物还是真核生物都有三种终止密码子UAG、UAA 和UGA。
• 没有一个tRNA能够与终止密码子作用，而是靠特殊的蛋白质 因子促成终止作用。
• 这类蛋白质因子叫做释放因子，原核生物有三种释放因子： RF1、RF2和RF3。RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA和 UGA，RF3的作用还不明确。真核生物中只有一种释放因子 eRF，它可以识别三种终止密码子。
• 遗传操作繁琐。
第二节 外源基因在大肠杆菌中的表达
1. 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 2. 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 3. 外源基因在大肠杆菌中表达形式 4. 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
1. 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌特征
原核生物基因表达特点
• 只有一种RNA聚合酶：识别原核细胞启动子，催化所有 RNA合成。
• 以操纵子为单位：数个相关结构基因与其调控区结合形成 一个表达的协同单位。
• 转录和翻译偶联、连续进行。
原核生物基因表达特点
• 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。 • 调控主要在转录水平上。 • mRNA的核糖体结合位点（rbs, SD）
Shine-Dalgarno（S-D）sequence： mRNA中用于结合原核生物核糖体 的序列。SD序列在mRNA起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处，富含嘌呤 的碱基序列，能与细菌16SrRNA的3’端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。
第八章 外源基因表达系统
• 基因表达
遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程 ——中心法则。
• 克隆基因的表达
外源基因在宿主细胞（原核细胞或真核细胞） 中的表达。
核糖体：合成蛋白质的“工厂” 核糖体由两个亚基构成
原核生物核糖体
真核生物核糖体
30S亚基
50S亚基
40S亚基
60S亚基
21种蛋白质 16SrRNA 34种蛋白
• PL启动子：来自 λ 噬菌体早期左向转录启动子，活性比Trp启动子高
11倍左右。 受控于温度敏感的阻遏物 cIts857。在低温(30℃)时， cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高温(45℃)时，cIts857蛋白失 活，阻遏解除，促使PL启动子转录。
• T7噬菌体启动子：来自 T7 噬菌体的启动子，具有高度的特异性，
➢ 信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子（SRP）识别并特异结 合，然后再通过SRP与膜上的对接蛋白（DP）识别并结合 后，将所携带的蛋白质送出细胞。
第一节 基因工程受体细胞
• 限制性缺陷型 避免修饰和降解
外切酶和内切酶活性缺陷（recB-/recC-/hsdR-）
• 重组整合缺陷型 避免重组整合
用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）
• Plac、Ptrp、 Ptac 、PL、 T7等。
• Lac启动子：乳糖操纵子，受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控
。负调控是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白。乳糖及某些类似物如IPTG可 与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这 种阻遏，诱导转录发生。
• trp启动子：色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。
基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究； • DNA重组实验和基因工程重要的真核受体细胞。
各种基因工程受体的特性
昆虫细胞
• 具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对 较快，培养成本低廉，遗传稳定；
• 适用于真核生物基因的高效表达； • DNA重组操作系统欠完善。
各种基因工程受体的特性
哺乳动物细胞（CHO、Hela）
表达、基因文库的构建。 • DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。 • 人胰岛素、生长激素、干扰素等。
各种基因工程受体的特性
枯草（芽孢）杆菌
• 遗传背景清楚，具有胞外酶分泌-调节基因，蛋白质分泌 机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素。
• 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有 效分泌。
氨基酸的活化
• 氨基酸的活化以及活化氨基酸与tRNA的结合，均由氨基酰 tRNA合成酶催化完成。
• 原核细胞中起始氨基酸活化后，还要甲酰化，形成甲酰甲硫 氨酸tRNA( fMet-tRNAfMet )。真核细胞没有此过程。
• 真核生物中与Met结合的tRNA有两种，Met-tRNAimet是具 有起始功能的，与Met结合后，可以在mRNA的AUG处就位， 参与形成翻译的起始复合物; Met-tRNAmet参与肽链延长， 它与Met结合，必要时进入核糖体，为延长中的肽链添加 Met 。
•原核细胞多肽链合成的起始
• 30S前起始复合物的形成：在起始因子2作用下，甲酰蛋氨酰起始tRNA与 AUG相结合，即密码子与反密码子配对，IF3从三元复合物中脱落，形成30S 前起始复合物。
• 70S起始复合物的形成：50S亚基与30S前起始复合物结合，IF2脱落，形成70S 起始复合物。此时fMet-tRNAfmet占据着50S亚基的肽酰位。而A位则空着有 待于对应mRNA中第二个密码的相应氨基酰tRNA进入，从而进入延长阶段。
5SrRNA
23SRNA 30多种蛋白质 18SrRNA 50多种种蛋白 5SrRNA
28SRNA
蛋白质生物合成
• 蛋白质生物合成可分为五个阶段，氨基酸的活化、多肽链合成 的起始、延长、终止和释放、蛋白质合成后的加工修饰。
• 蛋白质生物合成需核糖体、mRNA、tRNA、氨酰转移核糖核 酸 (氨酰tRNA)合成酶、可溶性蛋白因子等大约200多种生物大 分子同作用来完成。
大肠杆菌特征
大肠杆菌表达外源基因的劣势：
• 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能--无特异性空间构象的多肽链 • 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统--糖基化和磷酸化等 • 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白-- 表达产物不稳定 • 细胞周质内含有种类繁多的内毒素--人体热原反应
2. 外源基因在大肠杆菌 中高效表达原理
•真核细胞蛋白质合成的起始
真核细胞蛋白质合成起始复合物的形成中需要更多的起始因子 参与，因此起始过程也更复杂。
1）起始甲硫氨酸不需甲酰化 2）已发现的真核起始因子有近10种 3）真核mRNA没有SD序列，但5‘端帽子结构与其在核蛋白体就
位相关。帽结合蛋白（CBP）可与mRNA帽子结合，促进 mRNA与小亚基结合。
• 大肠杆菌大多数启动子与所属基因转录起始 位点之间的距离为6-9个碱基
启动子
基因工程常用的原核启动子（最佳启动子必须具备 的条件）：
• 强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%30%以上。 • 应呈现低水平的基础转录，便于表达毒性蛋白等。 • 应是可诱导型的，用温度或化学试剂诱导。
IAA诱导Ptrp介导的目基因的表达。
核糖体结合位点（RBS）
• 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于 转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的 翻译起始效率密切相关。
• mRNA翻译的起始效率主要由其5' 端的结构序列所 决定，称为核糖体结合位点（RBS）。
只有 T7 RNA聚合酶才能使其启动。效率比大肠杆菌 RNA聚合酶高5倍 左右。但要注意用这种启动子时宿主中必须含有T7RNA聚合酶。
启动子的可控性
• 外源基因的全程高效表达往往会对大肠杆菌的生理生化过 程造成不利影响；
• 通过可控性的启动子调整外源基因表达的时序，即通过启 动子活性的定时诱导，将外源基因的转录控制在受体细胞 生长的某一特定阶段。
肽链的合成后加工与修饰
• 高级结构的形成
1）构象的形成：在分子内伴侣、辅助酶及分子伴侣的协 助下，形成特定的空间构象。
2）亚基的聚合 3）辅基的连接
肽链的合成后加工与修饰
• 信号肽
➢ 分泌蛋白质及细胞膜蛋白质等，以前体物质多肽的形式合 成，其N末端含有作为通过膜时之信号的氨基酸序列，这 种氨基酸序列称信号肽或信号序列 ，由约15-25个氨基酸 所组成。
当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。 3-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活 性，促使trp启动子转录。
• Tac启动子：由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏
蛋白的Biblioteka Baidu调节，它的启动能力比Lac和trp都强。Tac启动子受IPTG的诱 导。
原核表达系统注意事项
①外源基因不能带有内含子 ② 必须用cDNA ③ 不能直接用真核基因组DNA ④ 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等） ⑤ 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害
大肠杆菌特征
大肠杆菌表达外源基因的优势：
• 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 • 基因克隆表达系统成熟完善 • 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 • 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物