植物提取物的分离纯化技术

苍山大蒜低聚糖纯化技术研究及分子质量测定

摘要：本论文旨在建立苍山大蒜中低聚糖（GOS ，Garlic oligosaccharide ）的分离纯化技术，并测定其分子质量。分别研究了聚酰胺色谱法、离子交换色谱法、有机溶剂沉淀法和葡聚糖凝胶色谱法对GOS 的纯化效果。结果表明，聚酰胺色谱柱对大蒜粗糖中蛋白质的脱除率为66.8%，糖回收率为98.9%；经DEAE-纤维素（OH -）色谱柱、乙醇分级沉淀和Sephadex G-25色谱柱纯化后，GOS 的纯度为99.1%，数均分子质量为1770D ，31.1/=n w M M 。

关键词：大蒜；低聚糖；分离纯化

大蒜营养丰富，在我国历来被视为药食两用的佳品。据报道，大蒜有降血脂、抗菌消炎、抗肿瘤、保护肝脏和抗衰老等作用[1-3]。其中，大蒜中的糖类物质是蒜中的主要活性成分之一[4-8]。大蒜低聚糖属杂果聚糖[8-10]，具有益生元的作用[11]。低聚果糖有双向调节人体肠道微生态的功能，且低聚果糖很难被人体消化吸收，是一种低能量的糖，不会引起肥胖。低聚果糖作为一种水溶性膳食纤维，能降低血清胆固醇和甘油三酯含量，所以低聚果糖也可作为高血压、糖尿病和肥胖症等患者使用的甜味剂[12]。

由于大蒜产地和品种等不同，对经分离纯化得到的大蒜多糖性质的研究报道并不一致。苍山大蒜的外形较差，不宜作为商品直接出售。但苍山大蒜富含低聚糖，具有较高的开发利用价值。本文旨在建立苍山大蒜低聚糖的分离纯化技术，并测定其分子质量，为大蒜低聚糖的进一步研究及应用提供基本方法。

1． 材料与方法 1.1 材料与试剂

大蒜 苍山大蒜；聚酰胺（30-60目） 国药集团上海试剂公司；DE-52 Whatman 公司；Sephadex G-25、蓝色葡聚糖-2000 Pharmacia 公司；果糖标准品 Amresco 公司；多糖标准品 Fluka 公司；其它试剂均为国产分析纯。 1.2 仪器与设备

TDZ5-WS 型离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；IGJ0.5冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；752型紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；BS-100A 自动部分收集器 上海沪西分析仪器厂有限公司；高效液相色谱系统 日本岛津公司；高效液相色谱柱 奥秘BauloSB5-2546-c18-060 C18柱（4.6 mm ×250 mm ，5 μm ）。 1.3 技术路线

鲜蒜→高温灭酶→破碎→提取→沉淀→冻干→纯化 1.4 方法

大蒜粗糖提取采用本实验室前期建立的方法[13]。 1.4.1蛋白质脱除效果的比较研究

Sevag 法对蛋白质的脱除效果研究：称取10.0g 粗糖干粉溶于100mL 蒸馏水中，配成粗糖溶液，加入20mL 的Sevag 试剂（氯仿：正丁醇=5：1，V/V ），剧烈振摇20min ，静置30min ，3000r/min 离心15min ，收集上清液，重复操作数次，至无变性蛋白质出现为止。考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量[14]，苯酚-硫酸法测定总糖含量[15]，计算糖损失率和蛋白质脱除率。

聚酰胺柱色谱法对蛋白质的脱除效果研究：取一定量的大蒜粗糖上样（φ2.5cm ×34cm ），蒸馏水洗脱，分别采用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝G-250法测定洗脱液中的总糖和蛋白质含量。计算糖损失率和蛋白质脱除率。

量取7mL 聚酰胺装柱（φ1cm ×20cm ），2g 粗糖上样，蒸馏水洗脱，至无糖洗出为止。测定洗脱液中蛋白含量，计算动态吸附容量。

1.4.2 大蒜低聚糖的DEAE-纤维素色谱柱法纯化

经脱蛋白后的大蒜低聚糖1.5mL 上样（φ8mm ×170mm ），上样浓度为5%（g/mL ），梯度洗脱，流动相分别为：蒸馏水，0.05mol/L NaCl ，0.10mol/L NaCl ，0.15mol/L NaCl ，0.20mol/L NaCl ，0.25mol/L NaCl ，0.20mol/L NaOH 。自动部分收集器收集洗脱液（3min/管），共收集98管，苯酚-硫酸法测每管总糖含量，绘制洗脱曲线。收集主要组分，采用HPLC 测定其分子质量分布。色谱条件为：GPC 色谱柱：SB-802.5；流动相：三蒸水；流速：0.8mL/min ；柱温：30℃；柱压：3.0MPa ；示差折光检测器检测。 1.4.3 大蒜低聚糖的沉淀法分级纯化

称取2.0g 经DEAE-纤维素色谱柱纯化得到的中性糖，溶于10mL 蒸馏水。加10mL 95%（V/V ）乙醇，4℃静置2h ，3500r/min 离心15min ，收集沉淀（记作沉淀1），上清液继续加10mL 95%（V/V ）乙醇，收

集沉淀2，重复上述步骤8次，最后一次醇沉后，上清液水浴挥干，收集干物质。HPLC 测定不同沉淀组分的分子质量分布（方法同1.4.2）。

1.4.4 大蒜低聚糖的葡聚糖凝胶Sephadex G-25色谱柱法纯化

取分级沉淀5至8的合并样品10mg 溶解上样（φ12mm ⨯300mm ），蒸馏水洗脱，流速5d/min ，自动部分收集器收集（7min/管），测定洗脱液中总糖含量，绘制洗脱曲线，收集主峰部分，真空浓缩，冷冻干燥。HPLC 法检测其分子质量（方法同1.4.2）。

2． 结果与分析 2.1 蛋白质脱除效果

大蒜粗糖中蛋白质含量为3.5%±0.1%。Sevag 法脱蛋白需重复7次，才能脱除粗糖中的游离蛋白，糖损失率为37.0%，蛋白质脱除率为71.4%。聚酰胺柱色谱法脱蛋白一次，糖损失率1.1%，蛋白质脱除率为66.8%，聚酰胺对蛋白质的动态吸附容量为6.01±0.03mg/mL 。说明聚酰胺柱色谱法具有良好的蛋白质脱除效果。

2.2 DEAE-纤维素色谱柱对大蒜低聚糖的纯化效果

DEAE-纤维素（OH -）色谱柱对大蒜低聚糖的分离效果见图1。由图可知，DEAE-纤维素（OH -）色谱柱可把脱蛋白后的大蒜低聚糖分离成3个组分，所用洗脱液依次为蒸馏水、0.05mol/L NaCl 、0.20mol/L NaOH 。收集组分主峰部分，HPLC 分析结果见图2，由检测结果可知，分子质量分布不均一，需进一步纯化。

图1 大蒜低聚糖在DEAE-cellulose （OH -）色谱柱上的洗脱曲线

注：H 2O ：1-30管，0.05mol/L NaCl ：31-46管，0.10mol/L NaCl ：47-56管，0.15mol/L NaCl ：57-65管，0.20mol/L

NaCl ：66-71管，0.25mol/L NaCl ：72-78管，0.20mol/L NaOH ：79-98管

图2 大蒜低聚糖DEAE-cellulose （OH -）色谱柱分离主峰部分分子质量分布检测结果

注：图中横坐标为时间(min)，纵坐标为影响强度(mV)

2.3沉淀法对大蒜低聚糖的分级纯化效果

采用乙醇分级沉淀法对中性糖进行纯化，得到沉淀曲线（图3）。沉淀量分别为：1.68%、1.37%、3.47%、41.70%

、15.26%、7.25%、4.71%、3.13%。通过HPLC 检测沉淀1至沉淀8，各沉淀组分分子质量分布见图4。由检测结果可知随乙醇添加量的增多，沉淀组分的主峰所占比例逐步提高，由沉淀1的72.3%上升为沉淀8的96.6%。沉淀5至沉淀8纯度均在96%以上，且分子质量均在1800D 左右，可以认为是同种物质，合并，继续纯化。

图3 大蒜中性糖的乙醇分级沉淀曲线

0.5

1

1.5

2

2.5

33.50102030405060708090100110

管号吸光度

0000

510

15202530354045123456789

沉淀%