发酵工程(菌种选育)重点

某些化学诱变剂常用浓度及处理时间
诱变剂 二乙酯 浓度 0.1～1% 处理时间(min) 18～24 60～120 中止方法
硫代硫酸钠或稀释 大量稀释
亚硝基胍 0.1～3㎎/ml
4）突变株的筛选
菌体细胞经诱变剂处理后, 要从大量的变异菌 株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来, 这
需要有明确的筛选目标和筛选方法, 需要进行认真
在生产过程中，不经人工处理，利用菌种的自然
突变而进行的菌种筛选过程。但突变的频率较低。
2.自然突变的两种可能
菌种衰退，生产能力下降；
代谢更加旺盛，生产性能提高。 3.自然选育的方法——单菌落纯种分离
五、诱变育种（Mutation breeding）
1.诱变育种的含义 应用微生物遗传和变异理论，用物理或 化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群, 促进其突变率大幅度提高, 然后采用简便、
诱变剂的含义： 凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素， 统称为诱变因素或诱变剂。 分类： 物理诱变，如紫外线、γ-射线、X-射线、
快中子、激光、等离子体、高压等
化学诱变，如硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝
酸、碱基类、吖啶类物质等
诱变剂量的选择：
一般来说，诱变率随诱变剂量的增高而提高，
因此，通常诱变剂量采用致死率90%～99%的剂量， 但是，对于经过一再诱变的高产菌，诱变剂量要低 得多（致死率在90%～99%）。 诱变处理的方法： 单一处理：一次用一种的诱变剂处理方法处理菌种 复合处理：两种以上的诱变处理方法处理菌种，这 种处理方法通常较单一处理的效果好。
菌悬液的细胞浓度一般控制为: 真菌孢子或酵母细胞 106～107 个/ml； 放线菌或细菌 108个/ml。 菌悬液一般用生理盐水(0.85% NaCl)稀释。 有时用化学诱变剂处理时，需要0.1mol/L 磷酸缓冲液稀释, 因为有些化学诱变剂处理时, 常常会改变反应液的pH值。
3）菌种诱变剂和使用剂量的选择

为提高分离的效率, 常以投其所好和取其所 抗的原则在培养基中添加特殊的养分或抗菌 物质, 使所需菌种的数量相对增加, 这种方 法称为增殖培养或富集培养, 其实质是使天 然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势 菌, 便于将它们从样品中分离。 例如分离放线菌时，在土壤样品悬液中加入 数滴10％的酚，可抑制霉菌和细菌的生长。

目的微生物富集的一些基本方法
富集的目的：
让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。
富集的主要方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的条件，
进行培养。控制营养和培养条件增加目的微生物数量， 也可高温高压、加入抗生素等减少非目的微生物的数量。
定向培养的富集方法
1.底物
3.培养时间

三、微生物菌种的选择性分离
菌株分离就是将一个混杂着各种微生物的样 品通过分离技术区分开，进而得到所需微生 物的过程。 工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分： 一是从自然界分离所需菌株；二是把分离的 菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。 菌株的分离和筛选：采样、富集、目的菌筛 选等。

1.采样

4.筛

选
平板上单菌落，通过菌落形态观察，进行菌落鉴定， 符合要求，转移到试管斜面进行纯培养。

采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶 的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产 用菌种。
5.毒性试验

自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其 作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关 的菌种，更应慎重。 据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、 黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试 验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的 毒性试验。
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌 →80℃、30min处理 ↓ 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5、 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落 采样（造纸 厂） 26株为组成型 从285个土样中获得62株 36株为诱导型
3.培养分离
2.诱变育种的一般步骤
1）出发菌株的选择
2）单细胞（或单孢子）悬液制备
3）诱变剂和使用剂量的选择 4）变异株的初筛 5）变异株的复筛 6）变异株稳定性试验 7）菌种特性考察 8）中试验证 9）大型投产试验
1）出发菌株的选择
用来育种处理的起始菌株称为出发菌株。
出发菌株的来源主要有以下三方面：
①自然界直接分离到的野生型菌株
第一章 微生物菌种选育
菌种选育：利用微生物的遗传变异的特性， 采用各种手段，改变菌种的遗传性状。 ◇自然选育：根据菌种自然变异的特点进行选 育的过程。 ◇人工选育：人为方式改变微生物菌株遗传物 质选育过程，包括诱变育种、杂交育种、原 生质体融合、基因工程育种等高新技术。

第一节 菌种的来源
一、工业发酵常见微生物种类 细菌

第二节 菌种的选育
一、菌种选育意义：发酵产品的种类、产量和质量有较大的 改善 二、菌种选育的定义： 根据微生物遗传物质极易发生变异特性，用人工方法
造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。
三、常用菌种的选育方法： 1）自然选育； 3）杂交育种； 2）诱变育种； 4）分子育种
四、自然选育
1.自然选育
诱变剂复合处理及协同效应
单独处理 诱变剂 突变率％ 复合处理 诱变剂 突变率％
菌种
土曲霉
紫外线 X－射线 黑曲霉 氮芥0.1％ 紫外线 链霉菌 二乙烯三胺 硫酸二乙酯 紫外线
21.7 19.7 不明显 4.7 6.06 1.78 12.5
紫外线 + X－射线
氮芥 + 紫外线
42.8
11.0
二乙烯三胺 + 紫外线 26.6 硫酸二乙酯 + 紫外线 35.86
快速和高效的筛选方法, 从中挑选少数符合
育种目的的突变株, 以供生产实践或科学研
究用。

诱变育种具有方法简单、快速和收效显著等 特点，仍是目前被广泛使用的主要育种手段。

当前发酵工业中使用的高产菌株，几乎都是 通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株。 诱变育种除能提高产量外 , 还可达到改善产 品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的。

尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的 混杂生长状态。因此还必须分离，纯化，在固体培 养基平板上获得单菌落。 纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。

分离的效率取决于培养基养分、pH、温度和 加入的选择性抑制剂。 嗜中性放线菌分离培养基pH常在6.7~7.5， 嗜酸性放线菌pH降至4.5~5.0。 放线菌筛选时，可加入真菌抗生素，对放线 菌无作用。 分离放线菌分离平板通常在25~30℃培养。 嗜热菌45~55 ℃ ，嗜冷菌4~10 ℃ 。
续诱变处理很可能导致产量下降甚至死亡。
因此，在实际生产中，一般可选择①或②类菌
株, 尤以第②类最佳, 因为它可以向好的方向发展。
在抗生素生产菌育种中，最好选择已通过几次
诱变并发现每次的效价都有所提高的菌株作出发菌
株，在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，最好
考虑至少能积累少量产品或其前体的菌株。
2）单细胞（或单孢子）悬液制备
2.pH条件
4.培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速 度的手段，培养（固体、液体；分批、 连续）后使目的微生物在种群中占优 势。
菌落的选出
从产物角度出发
在培养时以产物的形成有目的的设计培养基 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素
从形态的角度
菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产 生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观 上就可以初步识别。
1.能使分散状态细胞均匀地接触诱变剂；
2.它尽可能地避免出现表型延迟现象
表型延迟(Phenotypic lag)是指某一突变在
DNA复制和细胞分裂后, 才在细胞表型上显示
பைடு நூலகம்
出来, 造成不纯的菌落的现象。出现这种现象
的原因是诱变对象处于多核时期造成的。
霉菌和放线菌对数期细胞往往是多核的, 很可能一个
核发生突变, 而另一个核未突变, 若突变性状是隐性的, 在
第一节菌种的来源一工业发酵常见微生物种类?细菌?醋杆菌属的醋化醋杆菌弱氧化醋杆菌??乳酸杆菌?枯草杆菌?丙酮丁醇梭菌?大肠杆菌?谷氨酸棒状杆菌最常用的工业微生物?酵母菌?酿酒酵母??假丝酵母属?产朊假丝酵母?解脂假丝酵母?热带假丝酵母?毕赤酵母属汉逊酵母属最常用的工业微生物?霉菌?曲霉属?米曲霉?黑曲霉?青霉属?青霉菌
当代并不表现出来, 在筛选时就会被淘汰; 若突变性状是显
性的, 那么, 在当代就表现出来, 但在进一步传代后, 就会
出现分离现象, 造成生产性状衰退, 因此，应尽可能选择孢
子或单倍体的细胞作为诱变对象。
即使如此, 有时也会出现表型延迟现象, 这是因为诱变
剂往往只作用于DNA分子的一条单链，DNA 进一步复制后,
同样会出现不纯的菌落。这类表型延迟称为分离性延迟现象。
菌株的均一性
菌悬液的均一性可保证诱变剂与每个细胞
机会均等并充分地接触，避免细胞团中变异菌 株与非变异菌株混杂，出现不纯的菌落，给后 续的筛选工作造成困难。 为避免细胞团出现, 可用玻璃珠振荡打散 细胞团，再用脱脂棉花或滤纸过滤, 得到分散 的菌体。
最常用的工业微生物

放线菌
链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌
担子菌——菇类
☆多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。
藻类——自养微生物
☆人类的保健食品和饲料。
二、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、 工厂或菌种保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 从一些发酵制品中分离目的菌，如从酱油中 分离蛋白酶产生菌；从酒醪中分离淀粉酶或 糖化酶产生菌。

2.富集培养

富集培养可增加待分离菌的数量，增加分离的成功 率。

为了容易分离到所需的菌种，可以通过配制选择性 培养基，选择一定的培养条件来控制。
例如碳源利用的控制，可选定糖、淀粉、纤维素， 或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有 利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它 微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分 离就会顺利得多。

从自然界筛选
采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初 为好。 采土方式：在选好适当地点后，用小萨子 除去表土，取离地面 5-15cm处的土约 10g， 盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好， 标记，记录采样时间、地点、环境条件等， 以备查考。为了使土样中微生物的数量和 类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回， 以便及时分离。
醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 乳酸杆菌
枯草杆菌
丙酮丁醇梭菌 大肠杆菌
谷氨酸棒状杆菌
最常用的工业微生物

酵母菌
酿酒酵母 假丝酵母属 产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母 毕赤酵母属、汉逊酵母属
最常用的工业微生物

霉菌 曲霉属 米曲霉 黑曲霉 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉 根霉属 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 红曲霉属 紫红曲霉
细致的筛选工作。 育种工作中常采用随机筛选和理性化筛选这两 种筛选方法。
随机筛选：
菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单 菌落，在随机挑选单菌落中筛选出高产菌株。该方 法工作量极大。为了提高筛选效率, 可采用下列方 法增大筛选量。 （1）摇瓶筛选法；
这些菌株的特点是它们的酶系统完整, 染色体
或DNA未损伤，但它们的生产性能通常很差(这正是
它们能在大自然中生存的原因), 通过诱变育种,
它们正突变(即产量或质量性状向好的方向改变)的
可能性大。
②经历过生产条件考验的菌株 这些菌株已有一定的生产性状, 对生产环境有 较好的适应性, 正突变的可能性也很大。 ③经历多次育种处理的菌株 这些菌株的染色体已有较大的损伤,某些生理功 能或酶系统有缺损, 产量性状已经达到了一定水平， 它们负突变(即产量或质量性状向差的方向改变)的 可能性很大，可以正突变的位点已经被利用了，继
以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼 泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化 合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多， 如一些野果生长区和果园内。 纤维素酶产生菌选择枯枝落叶富含纤维素的 森林土； 淀粉酶产生菌选择面粉厂、酒厂、糕点厂等 场所的土壤； 蛋白酶和脂肪酶产生菌可选择肉类加工厂附 近污泥等。
诱变处理的菌株应考虑微生物的生理状态、菌
株的均一性和环境条件。
适合用于诱变育种的微生物生理状态： 一般要求细菌和酵母菌体处于对数生长期, 并 采取一定的措施促使细胞处于同步生长。 对产孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽 孢，因此，霉菌和放线菌应处于单细胞状态，即 形成孢子的时期，对孢子进行诱变。
为什么霉菌和放线菌用孢子进行诱变处理？