基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序
重点难点
1、基因工程基本操作程序的四个步骤
2、从基因文库中获取目的基因
3、利用PCR技术扩增目的基因
知识讲解
基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。

一、目的基因的获取
1、获取目的基因是实施基因工程的第一步
目的基因的获取方法主要有两种：
①从自然界中已有的物种中分离出来
②用人工的方法合成.
2、基因文库——将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，成为基因文库。

基因文库根据其大小可分为基因组文库和部分基因文库。

受体细胞是指接受目的基因的细胞，即表达载体导入的细胞。

基因工程常用的受体有细菌、真菌、动植物细胞
3、PCR技术扩增目的基因
原理：DNA复制
做法：已知一段目的基因的核苷酸序列→据已知序列合成引物→DNA扩增
结果：扩增出许多结构相同的目的基因
注意：学习该部分知识时，常出现将目的基因的来源和目的基因的提取相混淆，致使不理解课本所讲，原因是课本都用了“获取目的基因”字样。

目的基因的来源是：
（1）从自然界中已有的物种中分离出来.
（2）用人工的方法合成
目的基因的提取是指在基因工程操作时怎样获得目的基因，常用方法有二：
①从基因文库中直接获取
②如果需要大量的目的基因，需要对目的基因进行PCR技术扩增。

不管是从基因文库中获取的目的基因，还是需要进行扩增的目的基因，其来源既可能是从自然界中已有的物种中分离出来，也可能是人工合成的。

DNA复制与PCR技术的比较
DNA复制 PCR技术
场所细胞核内生物体外
原理碱基互补配对碱基互补配对
酶 DNA聚合酶、解旋酶热稳定DNA聚合酶（Taq酶）
条件模板、ATP、引物链、常温模板、ATP、引物链、温度变化（90℃～95
℃→55℃～60℃→70℃～75℃） 原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸
特点形成的是整个DNA分子，
短时间内形成大量目的基因DNA片段一个细胞周期只复制一次
二、基因表达载体的构建
基因表达载体的构建是基因工程的核心。

其中心内容是使目的基因与运载体结合，形成重组运载体，最后通过重组运载体将目的基因导入受体细胞。

注意：在学习时应注意以下几点：
1、构建表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且通过复制而遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

2、将目的基因与载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。

如果以质粒为载体，将目的基因与质粒结合的步骤是：
①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个黏性末端的切口。

②用同种限制酶切断目的基因，产生相同的黏性末端。

③将切下的目的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒
3、基因表达载体的组成：
①目的基因外源DNA分子的有效片段。

②启动子一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

③终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段。

终止子相当于一盏红色信号灯，使转录到此终止。

④标记基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。

4、所选运载体应具备的条件：
(1) 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去.这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。

(2)载体DNA必需具备自我复制的能力,或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA 的复制而同步复制。

(3)载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。

(4)载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。

(5)载体DNA分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作.
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件,都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。

三、将目的基因导入受体细胞
1、转化——目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。

说明：此处的"转化"与肺炎双球菌的转化实验中的“转化”的含义相同。

2、基因工程中常用的受体细胞有：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤脓杆菌、酵母菌和动植物细胞。

3、将目的基因导入受体细胞的方法：根据受体和运载体的类型不同,所采用的导入方法也不同。

目前常用的方法有：
①将目的基因导入植物细胞——脓杆菌转化法，还有基因枪法和花粉管通道法
②将目的基因导入动物细胞——显微注射技术
③将目的基因导入微生物细胞——Ca2+处理细胞法
四、目的基因的监测与鉴定
1、检测对象：
①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
2、检测方法：（分子杂交技术）
分子杂交技术是基因工程中使用频率较高的一项技术，主要用于检测和鉴定，可以为核酸分子之间的杂交和蛋白质分子之间的杂交。

常用技术有：
（1）DNA和DNA分子之间的杂交。

（2）DNA和RNA分子之间的杂交。

（3）蛋白质分子（抗原——抗体）之间的杂交。

3、个体生物学水平的鉴定
例如，一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫或抗病特性，还需要做抗虫或抗病的接种试验，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。

也就是说检测一下目的基因在受体细胞中是否表达——是否具有抗虫蛋白，以及此抗虫蛋白是否与天然的抗虫蛋白具有相同的生物活性。