高通量测序简介
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oding RNA)测序
LncRNA是一类长度超过200nt的长链非编码RNA，通 过与DNA、RNA或蛋白质结合，在表观遗传、转录及 转录后等水平调控基因表达。
lncRNA测序是研究已有参考基因组物种的特定组织或 细胞在某个特定时期转录出的所有lncRNA和mRNA。
数据量 3.3-3.8GB 4.5-5.1GB 7.8-8.5GB 13.2-15GB
适用范围 靶向测序、小基因组测序、靶向基因表达分析
特点
唯一一台在单次运行产生2x300 bp双端reads 的测序仪。
Hiseq 4000
测序通量
适用范围 特点
读长
测序时长
数据量
2×150bp
1300-1500GB
全基因组de novo测序是指对未知基因组序列的物种进行从头测 序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种 的基因组序列图谱。
基因组测序策略
外显子组测序 外显子组
一个物种基因组中全部外显子区域的总和； 人外显子组只占基因组的~1%，约30 Mb； 约85%的人类致病突变都位于这1%的蛋白质编码序 列上。
1st cycle annealing
n=30
diol diol
1st cycle extension
diol diol
2nd cycle denaturation
clusters
diol
diol diol
2nd cycle extension
diol
diol diol
2nd cycle annealing
碱基识别依次掺入4中碱基连续两个相同碱基结合iontorrentpgmiontorrent仪器展示chip类型pgm314pgm316pgm318传感器数13m63m11m数据100mb1gb2gb运行时间2347h3049h4473h200400bp200400bp200400bp应用范围扩增子测序靶向重测序小基因组测序基于半导体技术测序原理快速读出碱dna序列三高通量测序部分应用全基因组测序全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序通过序列比对可以找到大量的单核苷酸多态性位点snp插入缺失位点indel结构变异位点sv位点和拷贝数变异位点cnv
1×75 bp
1-3.5d
650-750GB
1×50 bp
215-250GB
全基因组测序、全外显子测序、转录组测序
最高的通量，每个样品的最低价格
测序通量
适用范围 特点
读长
测序时长
数据量
2×150bp
<3d
单流动槽
8-9TB
双流动槽
16-18TB
全基因组测序 超高的通量，有望突破人类全基因组测序的$1000大关
应用范围 特点
扩增子测序、靶向重测序、小基因组测序
基于半导体技术测序原理，快速“读”出碱 DNA序列
三、高通量测序部全分基应因用组测序
DNA
外显子组测序
2007年ABI SOLID
测序速度及通量提高了，但是后续海量的数据分析却成为一大难题； 靶向捕获测序（panel）
甲基化测序
年Picfic Biosciences SMRT Sequencing构建Small RNA测序
Small RNA 是长度约20-30nt的非编码RNA分子，主要 包括miRNA、siRNA、piRNA等，是生命活动重要的调 控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾 病的
Circ RNA是mRNA在剪接的过程中，上游exon的5’端与下游exon的3’端 剪接到一起，从而形成的首尾相接的环状RNA分子。
主要内容
一、高通量测序简介 二、 Solexa和Semiconductor测序原理 三、高通量测序部分应用
一、高通量测序简介
高通量测序（High-throughput sequencing）又称“下一代”测 序（“Next-generation”sequencing），可一次性对几百万到十 亿条DNA分子进行并行测序；
Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat
信号收集
读取碱基序列
在测序过程中，每种碱基被激发 后都会发出特殊波长的荧光
在每个循环过程中每一个簇只对 应一张图像
Illumina 测序平台展示
NextSeq 500
测序通量
适用范围 特点
读 长 测序时长 数据量
全基因组测序、全外显子测序、转录组测序
高通量测序 Illumina 测序平台展示
2006年Solexa Sequencing-By-Synthesis
扩增子测序
1992年Lynx Therapeutics MPSS
mRNA测序 扩增引物的5’端标记了生物素,通过链霉亲和素标记的磁珠与标记了生物素的DNA结合.
适用范围 全基因组测序、靶向重测序、转录组测序
特点
对几乎任何基因组、任何测序方法和规模的项目，都有可扩展的通 量，灵活简便。
a. 所有产出和read数量规格都基于单个流动槽计算，NovaSeq 6000系统可同 时运行1个或2个流动槽。
b. N/A: 不适用。
Ion Semiclent
Illumina
mRNA测序
mRNA测序(mRNA seq)是指利用高通量测序技术对 cDNA进行测序从而得到一个样品中基因表达、cSNP、 全新的转录、全新异构体、剪接位点、等位基因特异 性表达及通量提高了，但是后续海量的数据分析却 成为一大难题；
✓ 不适合小规模测序； ✓ 新一代测序仪价格昂贵。
谢谢！ &问题？
碱基识别
依次掺入4中碱基 连续两个相同碱基结合
Ion Torrent仪器展示
Ion Torrent PGM
Chip类型
PGM314
PGM316
PGM318
传感器数
1.3M
6.3M
11M
数据量
~100MB
~1GB
~2GB
运行时间
2.3/4.7h
3.0/4.9h
4.4/7.3h
读长
200/400bp 200/400bp 200/400bp
可以对一个物种的基因组和转录组进行深入、细致和全貌的 分析，所以又被称为深度测序（Deep sequencing）。
高通量测序的发展
1992年Lynx Therapeutics MPSS 2003年Polony Sequencing(哈佛） 2005年454 Pyrosequencing 2006年Solexa Sequencing-By-Synthesis 2007年ABI SOLID 年Helicos tSMS Sequencing 年Ion Torrent Semiconductor Sequencing 年Picfic Biosciences SMRT SequencingPCR产物纯化制备接头连接片段筛选
样本混池
克隆扩增
不理想的扩增情况
ISP富集（Ion Sphere Partical Enrichment）
扩增引物的5’端标记了生物素,通过链霉亲和素标记的磁珠与标记了生物 素的DNA结合.
测序
自然情况下，DNA聚合酶将一个核苷酸渗入到DNA分子中就会释放出一个H+，导致局部可 检验的PH值发生变化，被离子传感器检测到，从而转换为数字信号。
Ion Semiconductor
Lnc RNA测序
RNA Small RNA测序
Circular RNA测序
人基因组重 动植物基因组 微生物基因组 全外显子组 靶向捕获测序（
全基因组测序
全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基 因组测序，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位 点（SNP），插入缺失位点（InDel）、结构变异位点（SV）位 点和拷贝数变异位点（CNV)。
并行合成测序法(SBS, SEQUENCING-BY-SYNTHESIS)和可逆性末端终止技 术（REVERSIBLE TERMINATOR CHEMISTRY）
3’ 5’
A T
C
G C
TG
T A
C
C
AT
G A
G
T
A
A C
T
C
C
G
G
A
C
T
C
G
A
T
Cycle 1: Add sequencing reagents First base incorporated Detect Signal Cleave Terminator and Dye
2×150bp ~29h
100-200GB
2×75 bp 18h
50-80GB
1×75 bp 11h
25-30GB
全基因组测序、全外显子测序、转录组测序
高通量、灵活性、简便
MiSeq
测序通量
读长 2×75bp 2×150bp 2×250bp 2×300bp
测序时长 ~24h ~24h ~39h ~55h
近年的研究表明，circRNA分子富含miRNA结合位点，在细胞中起到 miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶 基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机 制。
通过与疾病关联的miRNA相互作用， circRNA在疾病中发挥着重要的调 控作用。
高通量测序的主要代表平台有:
罗氏的(Roche)的454测序仪（Roche GS FLX sequencer）; Illumina的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）; ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）; Thermo Fisher的离子半导体测序仪（Ion Semiconductor
HiSeq X Ten
NovaSeq 6000
数据量a
流动槽类型 1×50bp 1×75 bp 2×150 bp
S1 167GB 333GB 500GB
S2
S3
S4
280-333GB N/Ab
N/Ab
<19h
560-667GB N/Ab
N/Ab
<29h
850-1000GB 2000GB 3000GB <40h
簇生成，模板变性
OH OH
diol
P7
P5
flowcell
diol diol
Template hybridization
diol diol
Initial extension
diol diol
Denaturation
桥式扩增
diol diol
1st cycle denaturation
diol diol
sequencer).
二、Solexa和Semiconductor测序原理
LOWCELL
Lane 1 Lan.e 2
.
Lan.e 8
Each lane contains 2 columns
Tile
Each column contains 60 tiles
Each tile is imaged 4 times per cycle
LncRNA是一类长度超过200nt的长链非编码RNA，通 过与DNA、RNA或蛋白质结合，在表观遗传、转录及 转录后等水平调控基因表达。
lncRNA测序是研究已有参考基因组物种的特定组织或 细胞在某个特定时期转录出的所有lncRNA和mRNA。
数据量 3.3-3.8GB 4.5-5.1GB 7.8-8.5GB 13.2-15GB
适用范围 靶向测序、小基因组测序、靶向基因表达分析
特点
唯一一台在单次运行产生2x300 bp双端reads 的测序仪。
Hiseq 4000
测序通量
适用范围 特点
读长
测序时长
数据量
2×150bp
1300-1500GB
全基因组de novo测序是指对未知基因组序列的物种进行从头测 序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种 的基因组序列图谱。
基因组测序策略
外显子组测序 外显子组
一个物种基因组中全部外显子区域的总和； 人外显子组只占基因组的~1%，约30 Mb； 约85%的人类致病突变都位于这1%的蛋白质编码序 列上。
1st cycle annealing
n=30
diol diol
1st cycle extension
diol diol
2nd cycle denaturation
clusters
diol
diol diol
2nd cycle extension
diol
diol diol
2nd cycle annealing
碱基识别依次掺入4中碱基连续两个相同碱基结合iontorrentpgmiontorrent仪器展示chip类型pgm314pgm316pgm318传感器数13m63m11m数据100mb1gb2gb运行时间2347h3049h4473h200400bp200400bp200400bp应用范围扩增子测序靶向重测序小基因组测序基于半导体技术测序原理快速读出碱dna序列三高通量测序部分应用全基因组测序全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序通过序列比对可以找到大量的单核苷酸多态性位点snp插入缺失位点indel结构变异位点sv位点和拷贝数变异位点cnv
1×75 bp
1-3.5d
650-750GB
1×50 bp
215-250GB
全基因组测序、全外显子测序、转录组测序
最高的通量，每个样品的最低价格
测序通量
适用范围 特点
读长
测序时长
数据量
2×150bp
<3d
单流动槽
8-9TB
双流动槽
16-18TB
全基因组测序 超高的通量，有望突破人类全基因组测序的$1000大关
应用范围 特点
扩增子测序、靶向重测序、小基因组测序
基于半导体技术测序原理，快速“读”出碱 DNA序列
三、高通量测序部全分基应因用组测序
DNA
外显子组测序
2007年ABI SOLID
测序速度及通量提高了，但是后续海量的数据分析却成为一大难题； 靶向捕获测序（panel）
甲基化测序
年Picfic Biosciences SMRT Sequencing构建Small RNA测序
Small RNA 是长度约20-30nt的非编码RNA分子，主要 包括miRNA、siRNA、piRNA等，是生命活动重要的调 控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾 病的
Circ RNA是mRNA在剪接的过程中，上游exon的5’端与下游exon的3’端 剪接到一起，从而形成的首尾相接的环状RNA分子。
主要内容
一、高通量测序简介 二、 Solexa和Semiconductor测序原理 三、高通量测序部分应用
一、高通量测序简介
高通量测序（High-throughput sequencing）又称“下一代”测 序（“Next-generation”sequencing），可一次性对几百万到十 亿条DNA分子进行并行测序；
Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat
信号收集
读取碱基序列
在测序过程中，每种碱基被激发 后都会发出特殊波长的荧光
在每个循环过程中每一个簇只对 应一张图像
Illumina 测序平台展示
NextSeq 500
测序通量
适用范围 特点
读 长 测序时长 数据量
全基因组测序、全外显子测序、转录组测序
高通量测序 Illumina 测序平台展示
2006年Solexa Sequencing-By-Synthesis
扩增子测序
1992年Lynx Therapeutics MPSS
mRNA测序 扩增引物的5’端标记了生物素,通过链霉亲和素标记的磁珠与标记了生物素的DNA结合.
适用范围 全基因组测序、靶向重测序、转录组测序
特点
对几乎任何基因组、任何测序方法和规模的项目，都有可扩展的通 量，灵活简便。
a. 所有产出和read数量规格都基于单个流动槽计算，NovaSeq 6000系统可同 时运行1个或2个流动槽。
b. N/A: 不适用。
Ion Semiclent
Illumina
mRNA测序
mRNA测序(mRNA seq)是指利用高通量测序技术对 cDNA进行测序从而得到一个样品中基因表达、cSNP、 全新的转录、全新异构体、剪接位点、等位基因特异 性表达及通量提高了，但是后续海量的数据分析却 成为一大难题；
✓ 不适合小规模测序； ✓ 新一代测序仪价格昂贵。
谢谢！ &问题？
碱基识别
依次掺入4中碱基 连续两个相同碱基结合
Ion Torrent仪器展示
Ion Torrent PGM
Chip类型
PGM314
PGM316
PGM318
传感器数
1.3M
6.3M
11M
数据量
~100MB
~1GB
~2GB
运行时间
2.3/4.7h
3.0/4.9h
4.4/7.3h
读长
200/400bp 200/400bp 200/400bp
可以对一个物种的基因组和转录组进行深入、细致和全貌的 分析，所以又被称为深度测序（Deep sequencing）。
高通量测序的发展
1992年Lynx Therapeutics MPSS 2003年Polony Sequencing(哈佛） 2005年454 Pyrosequencing 2006年Solexa Sequencing-By-Synthesis 2007年ABI SOLID 年Helicos tSMS Sequencing 年Ion Torrent Semiconductor Sequencing 年Picfic Biosciences SMRT SequencingPCR产物纯化制备接头连接片段筛选
样本混池
克隆扩增
不理想的扩增情况
ISP富集（Ion Sphere Partical Enrichment）
扩增引物的5’端标记了生物素,通过链霉亲和素标记的磁珠与标记了生物 素的DNA结合.
测序
自然情况下，DNA聚合酶将一个核苷酸渗入到DNA分子中就会释放出一个H+，导致局部可 检验的PH值发生变化，被离子传感器检测到，从而转换为数字信号。
Ion Semiconductor
Lnc RNA测序
RNA Small RNA测序
Circular RNA测序
人基因组重 动植物基因组 微生物基因组 全外显子组 靶向捕获测序（
全基因组测序
全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基 因组测序，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸多态性位 点（SNP），插入缺失位点（InDel）、结构变异位点（SV）位 点和拷贝数变异位点（CNV)。
并行合成测序法(SBS, SEQUENCING-BY-SYNTHESIS)和可逆性末端终止技 术（REVERSIBLE TERMINATOR CHEMISTRY）
3’ 5’
A T
C
G C
TG
T A
C
C
AT
G A
G
T
A
A C
T
C
C
G
G
A
C
T
C
G
A
T
Cycle 1: Add sequencing reagents First base incorporated Detect Signal Cleave Terminator and Dye
2×150bp ~29h
100-200GB
2×75 bp 18h
50-80GB
1×75 bp 11h
25-30GB
全基因组测序、全外显子测序、转录组测序
高通量、灵活性、简便
MiSeq
测序通量
读长 2×75bp 2×150bp 2×250bp 2×300bp
测序时长 ~24h ~24h ~39h ~55h
近年的研究表明，circRNA分子富含miRNA结合位点，在细胞中起到 miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶 基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机 制。
通过与疾病关联的miRNA相互作用， circRNA在疾病中发挥着重要的调 控作用。
高通量测序的主要代表平台有:
罗氏的(Roche)的454测序仪（Roche GS FLX sequencer）; Illumina的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）; ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）; Thermo Fisher的离子半导体测序仪（Ion Semiconductor
HiSeq X Ten
NovaSeq 6000
数据量a
流动槽类型 1×50bp 1×75 bp 2×150 bp
S1 167GB 333GB 500GB
S2
S3
S4
280-333GB N/Ab
N/Ab
<19h
560-667GB N/Ab
N/Ab
<29h
850-1000GB 2000GB 3000GB <40h
簇生成，模板变性
OH OH
diol
P7
P5
flowcell
diol diol
Template hybridization
diol diol
Initial extension
diol diol
Denaturation
桥式扩增
diol diol
1st cycle denaturation
diol diol
sequencer).
二、Solexa和Semiconductor测序原理
LOWCELL
Lane 1 Lan.e 2
.
Lan.e 8
Each lane contains 2 columns
Tile
Each column contains 60 tiles
Each tile is imaged 4 times per cycle