实验方案-细胞表型检测

细胞表型检测
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 供试品
名称：人胎盘间充质干细胞、猴胎盘间充质干细胞的P4、P6、P8细胞1.1.2 主要试剂
B液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司
D液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司
血清新西兰胎牛血清(特级) 上海依科赛生物制品有限公司 IgG-FITC BD公司货号：555748
CD19-FITC BD公司货号：555412
CD34-FITC BD公司货号：555821
CD44- FITC BD公司货号：
CD31- FITC BD公司货号：
IgG-PE BD公司货号：555749
CD11b-PE BD公司货号：555483
CD45-PE BD公司货号：555388
CD73-PE BD公司货号：550257
CD90-PE BD公司货号：555596
CD105-PE Serotec公司货号：MCA1557PE
HLA-DR-PE BD公司货号：555812
CD29-PE BD公司货号：
1.1.3 主要仪器
CO2培养箱
离心机
超净工作台
显微镜
1.1.4 主要耗材
50ml离心管、5ml/10ml移液管、1.5ml EP管。

1.1.5 实验设计依据
通过传代培养，我们可以得到相对纯的间充质干细胞，参考国际细胞治疗协会提出的间充质干细胞表型方面的标准，CD73、CD90和CD105阳性率不低于95％；CD45、CD34、CD11b、CD19 和HLA-DR阳性率不高于2％[1]。

检测在传代过程中的细胞的表型是否会发生变化。

我们设计检测P4代、P6和P8代细胞表型。

1.2 实验方法
1.2.1细胞消化
1、将原培养液倒净,用移液管取D液10ml冲洗细胞，倒净,此操作重复洗2 次；
2、用移液管吸取加入B液2ml,盖上培养瓶盖子,摇晃使B液均匀覆盖瓶底,待细胞从培养壁脱落下来；
3、用移液管吸取加入C液0.5ml, 终止消化，再加D液10ml，吹打细胞制成细胞悬液，将细胞悬液收集至离心管中；
1.2.2 流式检测方法
1、收集细胞，1000rpm离心5min，用D液洗一次，过滤；
2、用适量D液将细胞重悬，100μl每管分装到1.5mlEP管中，每管细胞不少于用1×105，在每管中加入4μl要检测表型的抗体,室温避光放置30min；加入1mlD液混匀，离心弃上清，再用1mlD液混匀，离心弃上清，每管加入
350-500μl D液重悬，移入流式管待测即可；
3、用流式细胞仪检测荧光值,每管计数3000-10000个细胞；
4、分析数据。

1.3 C6操作步骤
（一）开机
1、启动控制计算机，进入软件，此时信号灯为红灯，显示还没有与C6连接。

2、检查四个液体容器，如有需要，则先充满液体或清空废液。

3、启动C6前方的电源按钮，此时信号灯变为黄色，显示C6正在启动，等待3分钟左右直至信号灯变绿，显示C6已经连接并就绪。

4、在载物台上放置一个空管，点击控制Backflush按钮，可以看到少许液体流出来。

5、在96孔样品格中任选一孔，载物台换上去离子水，选择高速，10分钟，点击RUN。

（激光器预热）
6、该孔因为收集了数据变成蓝色，点击Delete Sample Data删除。

至此启动步骤已完成，可以开始检测样品。

（二）检测样品
1、将样品依次置于载物台上。

2、在96孔样品格中选择不同的位置，依次命名。

3、设定检测停止的条件：
（1）无限制，手动点击停止；（2）收集了多少个点停止；（3）收集了多少时间停止；（4）收集了多少体积液体停止。

（2—4可复选，达到任一设定指标就会停止）。

4、设定进样速度：慢速，中速，快速或者自己设定。

5、设定阈值（一般不变，FCS-H>80000）。

6、点击RUN。

注意事项：1、样品之间无需用去离子水冲洗，但是当你完成所有样品检测后，
必须运行清洗程序（Instrument菜单下cleaning fluid cycle）。

2、若发生堵塞（观察每秒钟细胞数），则运行Backflush，再用去
离子水冲洗2min。

3、切记每测完一个样品必须保存（在开始检测时会提示你保存）。

（三）检测结果分析
（四）关机
1、在任意一个打开的文件下，在96孔样品格中任选一孔，载物台上放置洗液（0.1%次氯酸钠），选择高速，运行2分钟。

2、在96孔样品格中任选一孔，载物台换上去离子水，选择高速，运行2分钟。

3、将去离子水的检测管一直留在载物台上。

4、按一下C6前方的电源按钮关闭C6，此时信号灯为黄灯，显示C6正在关闭，关闭的过程大约需要10分钟左右。

5、退出控制软件，不用保存之前清洗步骤所收集的数据。

关闭电脑。

注意：与BD FACSAria不同，C6的关机程序所作的一系列相关步骤都是自动的，不需要与控制计算机相连接操作，C6与电脑控制软件相对独立，所以后面两个步骤（关闭C6和退出控制软件）无关先后。

细胞因子检测
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 供试品
名称：人胎盘间充质干细胞、猴胎盘间充质干细胞的P4、P6、P8细胞培养上清
1.1.2 主要试剂
B液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司
D液自配天津昂赛细胞基因工程有限公司
血清新西兰胎牛血清(特级) 上海依科赛生物制品有限公司
无血清培养基 Loza
人白细胞介素2酶联免疫分析上海泛柯
人白细胞介素6酶联免疫分析上海泛柯
人血小板生成素酶联免疫分析上海泛柯
人α干扰素酶联免疫分析上海泛柯
人肿瘤坏死因子α酶联免疫分析上海泛柯
人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子酶联免疫分析上海泛柯
人粒细胞集落刺激因子酶联免疫分析上海泛柯
1.1.3 主要仪器
CO2培养箱
离心机
超净工作台
显微镜
酶标仪
洗板机
1.1.4 主要耗材
50ml离心管、5ml/10ml移液管、1.5ml EP管、移液枪。

1.1.5 实验设计
空白孔1个，标准空2个，待测空3个。

1.2 实验方法
1.2.1样品收集
细胞融合达80%-90%时进行计数定量培养，细胞融合达70%时，用无血清培养基替换24h后收取细胞上清，-80℃冻存、待测。

操作方法如下：吸弃培养瓶中原有培养基，PBS轻加入培养瓶清洗，弃去洗液，共2次。

加入适量0.25%胰蛋白酶消化，显微镜下观察，细胞开始回缩变圆并漂浮时，立即加入含10%FBS的培养基终止消化，混匀制成细胞悬液。

1000rp离心10min，弃上清。

重悬细胞沉淀，台盼蓝染色计数。

5×104细胞/cm2接种于含有血清培养基1ml 的12孔板中。

37℃、5%CO2培养箱中培养。

每天显微镜观察细胞生长状况，待细胞铺满70%，更换无血清培养基；培养24h后收细胞上清于冻存管中，存放-80℃待测。

重复上述步骤，收取P4、P6、P8细胞上清留作待测样本。

1.2.2 操作步骤
1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

8. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。

测定应在加终止液后15分钟以内进行。

操作程序总结：
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。

一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。

如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。