抗菌药物筛选的实验方法与技术

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抗菌药物筛选的实验方法与技术
博哥
(中山大学化学与化学工程学院,广州510275)
摘要为了筛选出活性更好的抗菌药物,本实验采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选,测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度或IC50来评定药物活性。

结果显示,样品1(环丙沙星)对二者有杀菌作用,最小抗菌浓度都为1.56 μmol·L-1。

样品30仅对大肠杆菌有杀菌作用,最小抗菌浓度为1.56 μmol·L-1。

样品17、19、20、24、26、28,表现出对大肠杆菌较好的抑制作用,其中抑制活性最好的为样品28(2,5-二羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺),IC50值为1.72 μmol·L-1。

样品31、42表现出对金黄色葡萄球菌较好的抑制活性,IC50值分别为11.04 μmol·L-1和24.44 μmol·L-1。

关键词抗菌药物筛选体外实验微量稀释法
1 引言
一个新的化合物或分离提取的有效成分是否有抗菌作用,需要药理实验来证实。

一般采用体外实验方法,观察试验物对细菌有无杀灭作用或抑制作用。

药物对细菌代谢的影响、可以使
细胞呼吸量减低,或酶系统受到抑制等,因而出现细菌不生长或部分抑制,可借以判断药物对
细菌有无抗菌作用,或抗菌范围。

因此,体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要
环节。

体外实验的重要性在于方法简便,用药量少,短时间内能判断药物抗菌的广度和强度,
为深入体外实验和体内药效研究提供数据。

但是,体外实验是细菌与药物直接接触,没有机体
诸因素参与,故体外和体内实验的结果不一定完全一致,需两方面综合分析进行评价。

本实验进行微生物培养基的配置、灭菌与接种等操作,以熟悉细菌培养的过程,并采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选,测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最
小抑菌浓度或IC50来评定药物活性。

2实验部分
2.1药品
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、胰蛋白胨、琼脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl溶液、DMSO以44种化合物(见表1)。

表1 44种化合物与对应编号
2.2材料与仪器
天平、高压蒸汽灭菌锅、生化培养箱、超净工作台、酒精灯、移液器、96孔板、酶标仪、恒温箱、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗、药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管、报纸。

2.3实验方法
2.3.1玻璃器皿的洗涤和包装
将锥形瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中,用毛刷刷洗,然后用自来水及蒸馏水冲净。

移液管先用含有洗涤剂的水浸泡,再用自来水及蒸馏水冲洗。

洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。

培养皿由一盖一底组成一套。

可用报纸将几套培养皿包成—包、或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内,加盖灭菌。

(已由实验室完成)
2.3.2固体培养基的配制过程
表2 固体培养基药品与用量
药品牛肉膏蛋白胨NaCl 琼脂水pH 用量0.5g 1g 0.5g 1.5-2g 100ml 7.2 (1)称量及溶化:分别称取蛋白胨相NaCl的所需量,置于烧杯中,加入所需水量的2/3左右的蒸馏水;用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中,进行称量。

然后加入少量蒸馏水于小烧杯中,加热融化,倒入上述烧杯中。

将烧杯置于石棉网上加热,用玻棒搅拌,使药品全部溶化。

(2)调pH:待溶液冷至室温时,用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。

(3)定容:将溶液倒入量筒中,补充水量至所需体积。

(4)固体培养基加入所需量的琼脂,加热融化,补充失水。

(5)分装、加塞、包扎。

(6)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。

2.3.3棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎
制棉塞时,应选用大小、厚薄适中的普通棉花一快,铺展于左手拇指和食指如成的圆孔上,用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞,然后直接压入试管或锥形瓶口。

也可借用玻璃棒塞入,也可用折叠卷塞法制作棉塞。

制作的棉塞应紧贴管壁,不留缝隙,以防外界微生物沿缝隙侵入,棉塞不室过紧或过松,塞好后以手提棉塞,试管不下落为准。

棉塞的2/3在试管内,1/3在试管外。

2.3.4培养基的灭菌
培养基经分装包扎之后,应立即进行高压蒸汽灭菌,100Pa灭菌20min。

灭菌完毕,除去锅内剩余水分,保持灭菌锅干燥。

2.3.5斜面和平板的制作
(1)斜面的制作:将巳灭菌装有琼脂培养基的试管,趁热置于木棒上,使成适当斜度,凝固后即成斜面,斜面长度不超过试管长度1/2为宜。

如制作半固体或固体深层培养基时,灭菌后则应
垂直放置至冷凝。

(2)平板的制作:将装在锥形瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后,待冷李50°C左右倾入无菌培养皿中。

平板的制作应在火旁进行,左手拿培养皿,右手拿锥形瓶的底部或试管,左手同时用小指和手掌将棉塞打开,灼烧瓶口,用左手大拇指将培养皿盖打开一缝,至瓶口正好伸入,倾入10-12 ml的培养基,迅速盖好皿盖,置于桌上,轻轻旋转平皿,使培养基均匀分布于整个平皿中,冷凝后即成平板。

2.3.6斜面培养基接种
(1)左手拇指、食指、中指及无名指分别持菌种相待接种的培养基管,使菌种管口位前,待接种培养基管口位后,斜面部均应向上,勿成水平,以免管底凝结的水浸湿培养基表面或沾湿棉塞。

(2)右手持接种环,在火焰上烧灼灭菌,待冷。

(3)以有手手掌与小指,小指与无名指分别拔取并挟持两管棉塞,将两管管口迅速通过火焰灭菌。

(4)以灭菌并冷却的接种环伸入菌种管内,从斜面上沾取菌苔少许,退出菌种管,再迅速移入待接种的培养基管,自斜面底部轻轻向顶端婉蜒划线或在斜面作上下轻轻涂布,切勿划破培养基表面。

沾菌的接种环进出试管时,均不应触及试管内壁及管口。

(5)接种完毕,重新烧红接种环灭菌后插入试管架上。

两管管口迅速通过火焰2-3次,塞回棉塞。

(6)将接种管置37℃温箱培养18-24小时后观察生长情况。

2.3.7微量稀释法体外抗菌实验
(1)抗菌化合物的初步筛选
选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,取96孔培养板一块,在超净工作台内,酒精灯下,用无菌的连续移液器按表3加样,DMSO的最终浓度保持在1%,样品最终浓度为200 μmol/L,每个样品设两个平行孔。

震荡混合后37℃培养12h-18h,,再用酶标仪630nm侧吸光度。

表3 初步筛选加样方式
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 培养液200μl 样品1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
B 培养液200μl 样品1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
C 培养液200μl 样品12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
D 培养液200μl 样品12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
E 菌对照(2μl DMSO) 样品23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
F 菌对照(2μl DMSO) 样品23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33
G 菌对照(2μl DMSO) 样品34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
H 菌对照(2μl DMSO) 样品34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
(2) 最小抑菌浓度或IC50的测试
从上述筛选中选出11种抑制较好的化合物,用微量稀释法测定最小抑菌浓度或IC50,培养板样品的加入方法与表3类似,第1列相同,第2列到12列为选出的11个化合物,以2倍进
行稀释
3结果分析与讨论
3.1数据记录
表4 大肠杆菌药物初步筛选结果
123456789101112 A-0.0600.1030.0550.0070.0350.0000.0370.0320.0130.0060.0850.061 B-0.069-0.0640.0470.0010.054-0.0270.0460.0610.032-0.0010.0480.031 C-0.100-0.006-0.010-0.0550.0160.581-0.001-0.007-0.063-0.028-0.025-0.009 D-0.060-0.0030.0610.0490.284-0.022-0.043-0.011-0.053-0.0110.003-0.015 E0.069-0.012-0.0490.017-0.047-0.024-0.027-0.015-0.065-0.0520.0670.002 F0.048-0.035-0.055-0.027-0.0430.038-0.037-0.009-0.056-0.0570.0170.008 G0.0880.0040.0570.026-0.0390.0370.0410.1180.220-0.025-0.0160.015 H0.0840.1100.0640.0690.0180.0860.0740.1090.171-0.0650.1090.039
表5 金黄色葡萄球菌药物初步筛选结果
123456789101112 A-0.0870.0590.002-0.0300.009-0.0490.0100.009-0.011-0.0220.0120.022 B-0.0920.0640.0070.0170.0080.0530.043-0.0050.015-0.0070.0080.119 C-0.117-0.024-0.0130.029-0.023-0.017-0.0100.009-0.078-0.054-0.0020.034 D-0.083-0.0120.039-0.0010.025-0.019-0.062-0.058-0.066-0.047-0.0080.006 E0.0480.027-0.048-0.007-0.0390.057-0.043-0.037-0.079-0.0720.0570.022 F0.058-0.032-0.0340.009-0.002-0.005-0.047-0.024-0.069-0.0480.0710.030 G0.1490.0210.049-0.034-0.0170.023-0.0110.2190.484-0.0750.1070.034 H0.1230.1490.1440.0930.0810.0890.0860.1010.067-0.0770.0390.413
根据初步筛选结果,对大肠杆菌有较好抑制活性的化合物有样品1、17、19、20、23、24、
26、28、30、31和42,对金黄色葡萄球菌有较好抑制活性的化合物有样品1、9、17、19、20、
24、26、28、30、31和42,将选出的化合物用微量稀释法测定最小抑菌浓度或IC50。

表6 大肠杆菌最小抑菌浓度或IC50的测试
123456789101112 A-0.030-0.0260.0490.0080.0490.023-0.0460.039-0.043-0.0360.009-0.055 B-0.045-0.0440.042-0.030-0.0140.117-0.0550.009-0.047-0.033-0.018-0.075 C-0.107-0.105-0.067-0.092-0.069-0.098-0.107-0.055-0.081-0.077-0.0470.360 D-0.038-0.038-0.009-0.023-0.012-0.023-0.033-0.032-0.039-0.031-0.0130.025 E0.050-0.043-0.002-0.026-0.022-0.024-0.035-0.042-0.050-0.024-0.0090.115 F0.035-0.0570.0490.0480.0220.014-0.014-0.015-0.034-0.018-0.0100.027 G0.069-0.0380.0580.0550.0410.0060.0100.009-0.005-0.021-0.0030.064 H0.066-0.0670.0000.0430.0880.1070.0120.045-0.009-0.0200.0100.052
表7 金黄色葡萄球最小抑菌浓度或IC50的测试
123456789101112 A-0.025-0.0160.0310.0440.0060.050-0.0310.0780.0250.0180.016-0.030 B-0.046-0.0320.0170.0030.0000.019-0.0100.0500.0330.015-0.011-0.038 C-0.093-0.093-0.048-0.063-0.043-0.046-0.059-0.022-0.010-0.035-0.020-0.035 D-0.042-0.034-0.003-0.028-0.016-0.031-0.035-0.026-0.033-0.0460.0030.029 E0.048-0.0350.001-0.0110.012-0.018-0.038-0.030-0.042-0.039-0.0050.014 F0.039-0.052-0.001-0.052-0.052-0.027-0.003-0.037-0.032-0.0420.0050.018 G0.051-0.0330.061-0.045-0.0430.0330.0540.0360.0170.0120.0140.011 H0.065-0.0590.097-0.069-0.0620.1110.1290.0800.0940.0150.0440.085
3.2数据处理与分析
3.2.1 大肠杆菌药物筛选
从表6中可以看出第2组(样品1)和第10组(样品30)的数据全是负值且与空白值接近,证明在每一个浓度下,大肠杆菌都不能生长,所以最小抑菌浓度为1.5625 μmol/L,如果需要找出更准确的最小抑菌浓度,样品需要进一步稀释。

其他组化合物,不同稀释浓度样品测试结果出现规律性上升,因此作图找出IC50。

由于第6、11、12组数据波动较大,剔除。

数据处理如下:1.将(菌对照值-培养液值)/100 定为100%
2.样品抑菌率= [1-(样品1值-培养液值)/(菌对照值-培养液值)] ×100
3.用样品浓度为横坐标,样品抑菌率为纵坐标作图,可以求出抑菌率为一半时的样品浓度IC50.
表8 大肠杆菌药物筛选抑菌率与IC50
浓度/μmol·L-1样品17 样品19 样品20 样品24 样品26 样品28 200 5.45542.727 5.45591.81814.54589.091
10011.81877.27362.727100.00041.81892.727
50110.909133.636112.727147.273100.000123.636
2558.18270.90960.90980.00079.09185.455
12.551.81873.63670.00081.81888.18295.455
6.25 5.455 6.36430.00062.72763.63680.909
3.125-2.7270.00012.72740.90941.8185
4.545
1.562550.000 10.909-30.00039.0919.09158.182
b a
c t e r i c i
d
e r a t e
c/μmol·L
b a
c t e r i c i
d
e r a t e
c/
μmol·L -1
b a
c t e r i c i
d
e r a t e
c/μmol·L -1
图1 大肠杆菌抑菌率-浓度曲线
3.2.2 金黄色葡萄球菌药物筛选
从表7中可以看出第2组(样品1)数据全是负值且与空白值接近,证明在每一个浓度下,大肠杆菌都不能生长,所以最小抑菌浓度为1.5625 μmol/L ,如果需要找出更准确的最小抑菌浓度,样品需要进一步稀释。

11、12组化合物,不同稀释浓度样品测试结果出现规律性上升,因此作图找出IC 50。

数据处理步骤与3.2.1相同,结果如下:
表9 金黄色葡萄球菌药物筛选抑菌率 浓度/μmol ·L -1
样品31 样品42 200 33.333 78.431 100 59.804 86.275 50 68.627 83.333 25 46.078 20.588 12.5 53.922 35.294 6.25 44.118 31.373 3.125 35.294 38.235 1.5625
5.882
-34.314
b a
c t e r i c i
d
e r a t e
c/μmol·L -1
图2 金黄色葡萄球菌抑菌率-浓度曲线
表10 抗菌药物筛实验结果
大肠杆菌最小抑
菌浓度/μmol ·L -1
大肠杆菌
IC 50
金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度/μmol ·L -1
金黄色葡萄球菌IC 50
样品1 (环丙沙星)
1.56 ---- 1.56 ---- 样品17 (苯甲基-N-苯基亚胺) ---- 15.84 ---- ---- 样品19 (4-羟基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺)
----
12.06
----
样品20 (2-羟基苯甲基-N-3,5-二苯基亚胺)
----
22.71
----
----
样品24 (苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺)
----
5.19
----
----
样品26 (4-羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺)
----
4.72
----
----
样品28 (2,5-二羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺)
----
1.72
----
----
样品30 (2,4-二羟基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺) 1.56
----
----
----
样品31 (4-羟基苯甲基-N-3-羟基苯基亚胺)
----
----
----
11.04
样品42 (4-硝基-2',5'-二羟基偶氮苯)
----
----
----
24.44
3.2讨论
实验数据的波动教大,部分组数据并没有规律,可能由以下原因造成:
1. 实验由多个同学完成,每个同学操作不习惯不一样,造成的误差不同,导致的误差。

2. 操作不当,或无菌环境不够彻底,导致的细菌污染。

3. 微量稀释时操作不当,导致样品、酶液、细菌量不准确。

4结论
采用微量稀释法通过体外实验对44种化合物进行了筛选,测定其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度或IC50。

结果显示,样品1(环丙沙星)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有杀菌作用,最小抗菌浓度为1.56 μmol·L-1。

样品30(2,4-二羟基苯甲基-N-2,4-二甲氧基苯基亚胺)仅对大肠杆菌有杀菌作用,最小抗菌浓度为1.56 μmol·L-1。

样品17、19、20、24、26、28,表现出对大肠杆菌较好的抑制作用,其中抑制活性最好的为样品28(2,5-二羟基苯甲基-N-4-羟基苯基亚胺),IC50值为1.72 μmol·L-1。

样品31、42表现出对金黄色葡萄球菌较好的抑制活性,IC50值分别为11.04 μmol·L-1和24.44 μmol·L-1。

5感想与体会
通过这次实验学到了很多化学生物学方面知识,例如,培养基的制作,灭菌,细菌的接种和培养等,还学习了如何通过体外实验快速,经济地筛选出具有较好活性的抗菌药物。

抗菌药物筛选操作过程,对于无菌环境要求非常严格,要避免其他菌种干扰实验,此外对于细菌的状态也有要求,必须是处于对数生长期,否则实验结果不准确。

当然,操作的准确性也影响着实验结果,这是每次实验都必不可少的。

在这次实验中还使用了一些以前未使用过的仪器,例如,酶标仪,超净工作台等,丰富了见识。

相信通过这次实验,能丰富我们化学生物学方面的知识,对于药物的筛选也有更深入了解。

参考文献
1.化学生物学讲义-现代1抗菌药物筛选的实验方法与技术。

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