植物组织蛋白提取方法

植物蛋白质提取方法总汇
一、植物组织蛋白质提取方法
1、根据样品重量（1g 样品加入3.5ml 提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。

2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。

3、用离心机离心8000rpm40min4 C或11100rpm20min4 °C
4、提取上清液，样品制备完成。

蛋白质提取液：300ml
1 、1Mtris-HCl （PH8）45ml
2、甘油（Glycerol ）75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone ）6g
这种方法针对SDS-PAGE垂直板电泳！
二、植物组织蛋白质提取方法
氯醋酸—丙酮沉淀法
1 、在液氮中研磨叶片
2、加入样品体积3倍的提取液在-20 C的条件下过夜，然后离心（4 C 8000rpm以上1 小时）弃上清。

3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的3 -巯基乙醇），摇匀后离心（4C 8000rpm 以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。

4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15C 8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在 4 C待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80 C备用。

药品：提取液：含10%TCA和0.07%的3 -巯基乙醇的丙酮。

裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！
三、组织：肠黏膜
目的：WESTERN BLO检测凋亡相关蛋白的表达
应用TRIPURE提取蛋白质步骤：
含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每ImITRIPURE用量）
倒转混匀，置室温10min
离心：12000 g，10min，4 度，弃上清
加入0.3M盐酸胍/95 %乙醇：（2ml每ImITRIPURE用量）
振荡，置室温20min
离心：7500g ，5 min ，4 度，弃上清
重复0.3M 盐酸胍/95 %乙醇步2 次
沉淀中加入100%乙醇2ml
充分振荡混匀，置室温20 min
离心：7500g ，5min，4 度，弃上清吹干沉淀
1 % SDS溶解沉淀
离心：10000g，10min ，4 度
取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLO）T
存在的问题：加入1%SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。

解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER然后煮5- 10 分钟，效果很好的。

四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根
1 、200 毫克样品置于冰上磨碎
2、加lysis buffer ，离心，10000rpm，4 度，5min 取上清
3、重复离心5min
五、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等（1986）的方法进行。

100mg材料剪碎后加入1OmgPVP-4O（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即卩0.07% B -巯基乙醇），混匀，-20 C 沉淀1小时，4C, 15000 r/min 离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮（含10 mM3 - 巯基乙醇），再于-20 C沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80%丙酮（含10 mM3 - 巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

按每mg干粉加入20卩1（可调）UKS液[9.5 M 尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS 0.5%DTT（二硫苏糖醇），2% Ampholine （Amersham Pharmacia Biotech Inc ，pH3.5-10），6% Triton X-100] , 37C温育30min，期间搅动几次，28度（温度低，高浓度的尿素会
让溶液结冰）16000 r/min 离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。

或者-70 度保存。

六、植物根中蛋白质的抽取
（1）sample, 液氮研磨
（2）装1.5 ml centrifuge 用tube
（3）加1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul
（4）12000 rpm, 4 度, 10-15minite
（5）取上层液，蛋白质就在里面
三氯醋酸—丙酮沉淀法
1 、在液氮中研磨叶片
2、加入样品体积3倍的提取液在-20 C的条件下过夜，然后离心（4 C 8000rpm以上1小时）弃上清。

3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的3 -巯基乙醇），摇匀后离心（4 C 8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。

4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15 C 8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4C待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80 C备用。

药品：
提取液：含10%TCA和0.07%的3 -巯基乙醇的丙酮
裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml）,使用前再加入1M 的DTT65ul/ml 。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！
植物组织蛋白质提取方法（一）
1、根据样品重量（1g 样品加入3.5ml 提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。

2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。

3、用离心机离心8000rpm40mi n4C或11100rpm20mi n4C
蛋白质提取液：300ml
4 、提取上清夜，样品制备完成。

1 、1Mtris-HCl （PH8）45ml
2、甘油（Glycerol ）75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone ）6g 这种方法针对SDS-PAG，E 垂直板电泳！植物组织蛋白质提取方法（二）
三氯醋酸—丙酮沉淀法
1 、在液氮中研磨叶片
2、加入样品体积3倍的提取液在-20C的条件下过夜，然后离心（4C 8000rpm 以上1小时）弃上清。

3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的3 -巯基乙醇），摇匀后离心（4C 8000rpm 以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。

4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15C8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4C待用。

5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80C备用。

药品：
提取液：含10%TCA和0.07%的3 -巯基乙醇的丙酮
裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml）,使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！
TCA-丙酮沉淀法，有人做过落叶松的的花粉
步骤：
1 、液氮研磨充分
2、加入含10%TCA、0.07%的巯基乙醇的丙酮溶液，-20 度沉淀过夜
3、4度，1000rpm 离心1 个小时，弃上清。

4、加100%丙酮，含0.07%的巯基乙醇，沉淀一小时
5、4度，1000rpm 离心15分钟，弃上清
6、重复第4、5 步
7、80%丙酮，含0.07%的巯基乙醇，沉淀一小时
8、重复第5 步
9、沉淀干燥。

1 0.低温保存样品
TCA/丙酮法：
(1)取4g 果肉，用液氮在研钵中将其研磨成粉。

(2)加入12.5%冰冷的TCA/丙酮(含0.07% B -巯基乙醇)，匀浆液在-20 oC下，放置3h, 纱布过滤。

(3)滤液在20000g离心30min，收集沉淀。

(4)用冷丙酮洗3次，沉淀在4oC下干燥，备用。

2.匀浆法：
( 1 )称取4g 果肉，用液氮在研钵中研磨成粉。

(2)加入4ml 的匀浆缓冲液(匀浆液中含有20 mMTris-HCl (pH 7.5), 250 mMsucrose, 10 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 以及1% Triton X-100) ，继续研磨。

(3)匀浆液20000g 离心30min。

(4)将上清转移到新的离心管中，加入终浓度为
10%TCA溶液，4oC下放置2 h。

(5)20000g离心40min,收集沉淀。

(6)用冷丙酮洗3次，沉淀在4oC下干燥，备用。

3.酚提取法：
(1)称取4g 果肉,用液氮在研钵中研磨成粉。

(2)加入4ml 的匀浆缓冲液(匀浆液中含有20 mMTris-HCl (pH 7.5), 250 mMsucrose, 10 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM
DTT, 以及1% Triton X-100) ,继续研磨。

(3)匀浆液20000g 离心30min。

(4)在上清液中加入等体积的pH7.8 Tris-饱和酚，充分摇荡，混匀，10000g，4oC下离心
30min，上层为水相，中间白色物质为杂质，下层为酚相。

(注：当提高匀浆缓冲液中sucrose 的浓度到1M时，酚相会出现在上层。

)
(5)回收酚相,加入5倍体积含0.1M
乙酸铵的预冷甲醇，充分混匀，-20oC下过夜，沉淀蛋白。

(6)沉淀用含0.1M 乙酸铵的预冷甲醇洗2次。

预冷丙酮洗2次。

(7)沉淀在4oC下干燥，备用。