第4讲核酸分子杂交技术

第4讲核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术(DNA/DNAorDNA/RNA)
核酸分子杂交技术：具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链探针(序列已知，单链)
待测核苷酸序列(单链)
主要内容第一节分子杂交技术的理论基础第二节核酸分子杂交的方法第三节核酸杂交的探针
第一节分子杂交技术的理论基础
核酸分子杂交技术：1968年华盛顿卡内基学院(CarnegieIntituteofWahington)的RoyBritten及其同事发明的关键步骤：变性—杂交(复性)--检测信号—结论
变性
复性
DNA-DNA杂交双链分子
信号的采集与处理
结论
一、DNA变性与复性(一)DNA变性1、定义：某些理化因素导致两条DNA 链间的
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
2、变性的方法：1)热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子
链间的氢键完全断裂。

2)酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸
分子链间的氢键断裂。

3)化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链
核酸分子链间的氢键断裂
3、核酸溶液变性后的理化性质变化：
粘度降低密度增加紫外吸收值增加(利用DNA变性后波长260nm处紫
外吸收的变化追踪变性过程)
4、DNA变性曲线AT区先解链，GC区后解链，阶梯式曲线，当达到一
定温度时，DNA双螺旋几乎是同时解开的
变性DNA/总DNA
Tm值：50%DNA分子发生变性的温度(即熔解曲线中点对应的温度),这
一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度(meltingtemperature,Tm)Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度
5、GC含量与Tm值(meltingtemperature)之间的关系(G+C)%=(Tm-69.3)
某2.44
Tm=(G+C)%某0.41+69.3Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：pH值、离子强度和DNA的碱基比例DNA制剂不应保存在离子强度过低的
溶液中，一般保存在1mol/lNaCl溶液中较稳定
(二)复性1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原
则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。

具有互补序列的两条单链
核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和
寡核苷酸/RNA。

2、复性过程1)单链分子间碰撞形成局部双链2)局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列3)形成完整的双链分子
3、复性的速率方程(服从二级反应动力学)dC=K2C2dt将(1)积分
C=11+K2CotCo(1)
(2)C1一半单链DNA分子复性时，(2)式中的C为2o12
=
11+K2Cot
Cot1/2=
1K2
(3)
Cot1/2值越大，复性速度越慢
二、影响杂交的因素1、核酸分子的浓度和长度：
浓度
越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢
单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.1-
0.5μg,
浓度过高影响杂交效率
2、温度：
(1)DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20-25℃(2)RNA/DNA或
RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值(原位杂交时，杂交液中加入适量的甲酰胺，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落)
(3)用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃
3、离子强度：(1)低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加(2)高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定(当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度)
4、甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定(1)当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42℃杂交(2)如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交
5、核酸分子的复杂性：(1)核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度，Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比(Cot1/2值越大，复性速度越慢)
(2)两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA 的相对复杂性
6、非特异性杂交反应：(1)杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附(2)常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。

如鲑精DNA或小牛胸腺DNA,Denhart溶液或脱脂奶粉。