大豆球蛋白的组成多肽分离及氨基酸组分分析
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食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTR IES
大豆球蛋白的组成多肽分离及氨基酸组分分析 3
郑志雄 ,杨晓泉
(华南理工大学轻工与食品学院食物蛋白工程研究中心 ,广东 广州 , 510640)
摘 要 通过 Nagano方法制备得纯度达 95%以上的大豆球蛋白 ,以其为原料 ,通过制备型液相色谱 ,对大豆球 蛋白的组成多肽进行了分离 。结果显示 :以 DEAE2Sepharose Fast Flow为分离介质 ,以含有 6 mol/L 碳酰二胺和 0102 mol/L巯基乙醇 、pH值为 6145的 0105 mol/L 磷酸缓冲液为平衡液 ,通过对穿透液及梯度洗脱液的分部收 集 ,大豆球蛋白的组成多肽能得到较好的分离 ,回收率达到 75% ,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示各组分的纯度达 90%。此外 ,对各组成多肽的氨基酸组分及种类进行了分析 。 关键词 大豆球蛋白 ,多肽 ,分离 ,制备型液相色谱 ,氨基酸组分分析
样品按 1∶100 ( g∶mL )溶于 6mol/L HCl,密封后 110℃水解 24 h。使用装 P ICO1TAG柱的 HPLC系统 (W aters 510,美国 )于 38℃、检测波长 254 nm、流速 110 mL /m in状态下对氨基酸组成进行测定 ,结果表 示为 g /100 g蛋白质 。
agano方法提取制得大豆球蛋白sd2page电泳图谱212大豆球蛋白肽分离纯化按照11312中的层析条件以211中大豆球蛋白为原料经离子交换色谱分离得到包含各洗脱组分的洗脱图谱见图研究结果比较本试验的洗脱峰数量多1个即最后那个nknown此外第ori等人的这可能是因为本试验上样量远远大于他们的实验2sepharosefastflow洗脱图谱分别对不同收集管的收集样品进行sd2page分析结果见图4
1 材料和方法
111 材料 低变性脱脂大豆片 (白豆片 ) ,由山东新嘉华有
限公司提供 。白豆片粉碎后 , 过 80 目筛并储存于 4℃下 密 闭 容 器 中 。豆 粉 蛋 白 质 含 量 为 ( 5515 ± 014) % , 氮 溶 指 数 8410%。树 脂 ( DEAE2sepharose fast flow)和柱子 ( 415 cm ×30 cm ) ,购自美国 GE公 司 。试剂为分析纯或更高级别 。 112 仪器
413
611
518
513
1015
组氨酸 ( H isd )
319
314
515
317
312
精氨酸 (A rg)
410
1119
2815
516
413
苏氨酸 ( Thrd )
的洗脱图谱 (见图 2) 。在洗脱图中 ,可观察到 6个主 峰 (分别标记为 1、2、3、4、5、6 ) 。与 Mori等 [ 8 - 9 ]研究 结果比较 ,本试验的洗脱峰数量多 1 个 ,即最后那个 小峰 (标记为 Unknown) ,此外第 1个峰和第 2个峰的 分离效果不如 Mori等人的 ,这可能是因为本试验上 样量远远大于他们的实验 (本试验上样量是其 10 倍 )。
- 210) 、A3 (管 220 - 240 ) 、A4 (管 241 - 263 ) 。因为 A1b被部分 B (碱性肽 )污染 ,所以不对 A1b进行收集 分析 。
将上述色谱技术得到的纯化多肽 (包括 A1a , A2 , A3 , A4 和 B )进行了进一步 SDS2PAGE分析 ,见图 5。 计算得 A1a , A2 和 A4 的分子质量约为 37 ku,而 A3 和 B 分 别 约 为 42 ku 和 18 ku。这 些 数 据 与 文 献 报
表 1 大豆球蛋白酸性肽和碱性肽的氨基酸组成 g/ (100 g) 样品
氨基酸
Ba
A1a a
A2 a
A3 a
A4 a
天冬氨酸 (A sp) 1110
1611
513
317
213
谷氨酸 ( Glu)
610
118
014
418
1011
丝氨酸 ( Ser)
513
216
718
318
310
甘氨酸 ( Gly)
凝胶成像系统 (W hite / U ltraviolet Tran Illum ina2 tor) ,美国 UVP公司 ; AKTA 蛋白质纯化仪 ,美国 GE 公司 ;垂直板电泳仪 ( PYCZ230) ,北京六一仪器厂 。 113 方法 11311 大豆球蛋白的制备
采用 N agano法 [ 10 ] 。将脱脂大豆粉按料水比 1∶ 15 ( g∶mL )分散 ,调 pH 至 715于室温下搅拌浸提 2 h, 然后 8 500 r/m in转速下离心 20 m in,取上清液 ,加入 亚硫酸氢钠 ,浓度为 0198 g /L ,调 pH 至 614, 4℃冷沉 10 h以上 ,在 4℃、1 000 r/m in离心 20 m in,沉淀物即 为大豆球蛋白 。 11312 大豆球蛋白组成多肽的分离纯化 [ 9, 11 - 12 ]
本研究通过对大豆球蛋白的组成多肽制备量小 问题的解决 ,为后期科学研究提供足够量的原料 。同 时对其氨基酸组分进行了分析 ,为相关研究提供理论 参考 。
第一作者 :硕士 (杨晓泉教授为通讯作者 ) 。 3 国家自然科学基金项目 ( 20776050) ;广东省自然科学基金项目
(07006508) ;教育部高校博士点基金 (20070561059) 收稿日期 : 2009 - 05 - 25,改回日期 : 2009 - 09 - 03
2009 年第 35 卷第 11 期 (总第 263 期 ) 145
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTR IES
上样 10 g的总回收率约 75% ,略低于之前 Wolf[ 9 ]上 样 1g的 90%。可见 ,回收率的差异可能是由于上样
量不同造成的 。然而 ,利用此色谱分离技术分离得到
的多肽量已经远远大于以前分离方法所得 ,给后期大
豆球蛋白的组成多肽物理化学及功能性质的研究打
下了坚实的基础 。
213 氨基酸组成
图 4 DEAE2Sepharose fast flow洗脱收集的 后 3个组分的电泳图谱
分离所得酸性肽和碱性肽的氨基酸组成列于表 1。这些多肽含有丰富的 Glu (谷氨酸 )和 A sp (天门 冬氨酸 ) ,这是一个典型植物种子蛋白的氨基酸组成 分布图 。然而 ,这 2种氨基酸的水平随多肽的类型而
2 结果与分析
211 大豆球蛋白制备 所得大豆球蛋白呈现出典型的酸性肽和碱性肽
的 SDS2PAGE电泳图谱 (见图 1) ,对应分子质量分别 约为 35 - 40 ku和 18 ku。光密度扫描结果显示酸性 肽和碱性肽之和占该泳道光密度强度的 95% ,即提 取的大豆球蛋白纯度达到 95%。纯度已适合进行下 阶段的研究 ,故未进行进一步的纯化 。
利用 DEAE2sepharose Fast Flow对大豆球蛋白中 的多肽进行分离纯化 。 10g大豆球蛋白溶于 90 mL 含有 610 mol/L 碳酰二胺 (尿素 )和 0102 mol/L 巯基 乙醇 、pH 值为 6145的 0105 mol/L 磷酸缓冲液中 ,即 为样品溶液 ,上样速度为 1 mL /m in。采用氯化钠溶 液为梯度洗脱液 ,其线性梯度浓度为 0 - 0135 mol/L , 流速为 5 mL /m in。根据洗脱液的 280 nm 吸光值所 体现的洗脱峰分别自动收集相应组分并于去离子水
大豆中蛋白质含量约为 40% ,根据沉降系数来 分 ,大豆蛋白可分为 2S, 7S, 11S, 15S 4个部分 。其中 7S和 11S占大豆蛋白总量的 70%以上 。 7S常称为 大豆伴球蛋白 , 11S称为大豆球蛋白 [ 1 ] 。
大豆球蛋白通常是分子质量约 35 万 u 的六聚 体 , 由 5 个 亚 基 ( A1a B2 , A1b B1b , A2 B1a , A3 B4 和 A5 A4 B3 )组成 ,每个亚基由一条 317 - 412 万 u 的酸 性肽 (p I < 7的多肽链 ,简称 A ,包括 A1a , A1b , A2 , A3 , A4 和 A5 )和一条约 2万 Da的碱性肽 ( p I > 7 的多肽 链 ,简称 B ,包括 B1a , B1b , B2 , B3 和 B4 )通过一个二硫 键连接 [ 2 ] 。前人已将 5 个亚基进行了分离 、纯化 [ 3 ] 并对氨基端氨基酸序列进行了表征 [ 4 ] 。国外科学家 对组成上述 5个亚基的酸性肽和碱性肽的分离方法 进行了许多研究 ,如 L iu[ 5 - 6 ]等采用在大豆球蛋白溶 液中加入巯基乙醇然后加热的方法 ; Kella[ 7 ]采用先 用巯基乙醇打开二硫键 ,然后利用离子交换填料对其 组成多肽进行选择性静态吸附的方法 。不难发现 ,以 上研究者分离得到的是酸性肽 、碱性肽的混合物 。 Moreira等 [ 4, 8 - 9 ]利用离子交换色谱分离方法对酸性 肽和碱性肽进行了分离 ,但是制备量太少 ,从而限制 了对其理化性质及功能特性的研究 。
图 1 Nagano方法提取制得大豆球 蛋白 SDS2PAGE电泳图谱
212 大豆球蛋白肽分离 、纯化 按照 11312中的层析条件 ,以 211中大豆球蛋白
为原料 ,经离子交换色谱分离 ,得到包含各洗脱组分
图 3 DEAE2Sepharose fast flow洗脱收集的 前 4个组分的电泳图谱
结合收集峰和电泳图谱 ,将纯的组分进行收集 。 具体为 : B (管 20 - 60) 、A1a (管 110 - 160) 、A2 (管 170
相对变化 。碱性肽的谷氨酸含量远低于酸性肽 (见
泳道 1 - Marker,泳道 2 - 大豆球蛋白 ,泳道 3 - B , 泳道 4 - A1a ,泳道 5 - A2 ,泳道 6 - A3 ,泳道 7 - A4
图 5 分离多肽的 SDS2PAGE电泳图谱
表 1) 。在酸性肽中 , A1a、A2 和 A3 的谷氨酸含量相 似 ,但远低于 A4 。至于天门冬氨酸 , A3 中含量最高 , A1a中含量最低 。碱性肽中的谷氨酸和天门冬氨酸含 量与 Mo 等 [ 6 ] 的 观 察 相 似 。A1a , A2 和 A3 (特 别 是 A3 )中谷氨酸的含量不同于 Moreira等 [ 4 ]的报道 。这 些差异可能是由于不同的多肽纯度和测定方法所引 起的 。
由于天门冬氨酸 /天门冬酰胺和谷氨酸 /谷氨酰 胺可以将酸性特性传递给蛋白质 [ 14 ] ,因此这些氨基
道 [ 8 - 9 ]一致 。光密度扫描技术分析得 : B , A1a , A2 , A3 酸的差异可能引起多肽在某些理化和功能特性方面 和 A4 的纯度分别为 9514, 100, 100, 9111和 111 ( To ta l 263 )
分离与提取
中 4℃透析 36h,中间换水 4次 ,然后真空冷冻干燥使 用。 11313 十 二 烷 基 钠 2聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ( SDS2 PA GE )
SD S2PAGE电泳采用 Laemm li [ 13 ]的方法 ,选择分 离胶单体质量浓度为 120 g /L、浓缩胶单体质量浓度 为 40 g /L 的凝胶体系 。样品溶液与 SDS2PAGE 样品 缓冲液 (含有 5%巯基乙醇和 2% SDS) 直接相混合 (体积比为 1 ∶1 ) ,电泳前沸水浴 5 m in。上样量为 15μL ,凝胶电泳于恒流下进行 ,在浓缩胶中为 15 mA ,进入分离胶后增加至 20 mA。凝胶染色液采用含有 0125%的考马斯亮蓝 R2250,脱色采用高甲醇的醋酸 溶液 , V (甲醇 ) ∶V (醋酸 ) ∶V (水 ) = 277∶37∶263 。 凝胶染色以及脱色后 ,于凝胶成像系统进行成像处 理 ,同时进行光密度扫描分析 。 11314 氨基酸组成分析
图 2 大豆球蛋白的组成多肽 DEAE2Sepharose fast flow洗脱图谱
分别对不同收集管的收集样品进行 SDS2PAGE 分析 ,结果见图 3和图 4。结合图 2以及图 3和图 4, 不难发现 ,峰 1前部分为纯的碱性肽 ,而后部分与峰 2重叠 ,而资料 [ 8 - 9 ]显示 ,峰 2为 A1b ,峰 3为 A1a ,峰 4 为 A2 ,峰 5为 A3 ,峰 6为 A4 ,而标记为 Unknown的峰 6资料中未见说明 ,电泳图谱 (见图 4 )显示 ,其分子 量要比峰 6即 A4 要小 。
大豆球蛋白的组成多肽分离及氨基酸组分分析 3
郑志雄 ,杨晓泉
(华南理工大学轻工与食品学院食物蛋白工程研究中心 ,广东 广州 , 510640)
摘 要 通过 Nagano方法制备得纯度达 95%以上的大豆球蛋白 ,以其为原料 ,通过制备型液相色谱 ,对大豆球 蛋白的组成多肽进行了分离 。结果显示 :以 DEAE2Sepharose Fast Flow为分离介质 ,以含有 6 mol/L 碳酰二胺和 0102 mol/L巯基乙醇 、pH值为 6145的 0105 mol/L 磷酸缓冲液为平衡液 ,通过对穿透液及梯度洗脱液的分部收 集 ,大豆球蛋白的组成多肽能得到较好的分离 ,回收率达到 75% ,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示各组分的纯度达 90%。此外 ,对各组成多肽的氨基酸组分及种类进行了分析 。 关键词 大豆球蛋白 ,多肽 ,分离 ,制备型液相色谱 ,氨基酸组分分析
样品按 1∶100 ( g∶mL )溶于 6mol/L HCl,密封后 110℃水解 24 h。使用装 P ICO1TAG柱的 HPLC系统 (W aters 510,美国 )于 38℃、检测波长 254 nm、流速 110 mL /m in状态下对氨基酸组成进行测定 ,结果表 示为 g /100 g蛋白质 。
agano方法提取制得大豆球蛋白sd2page电泳图谱212大豆球蛋白肽分离纯化按照11312中的层析条件以211中大豆球蛋白为原料经离子交换色谱分离得到包含各洗脱组分的洗脱图谱见图研究结果比较本试验的洗脱峰数量多1个即最后那个nknown此外第ori等人的这可能是因为本试验上样量远远大于他们的实验2sepharosefastflow洗脱图谱分别对不同收集管的收集样品进行sd2page分析结果见图4
1 材料和方法
111 材料 低变性脱脂大豆片 (白豆片 ) ,由山东新嘉华有
限公司提供 。白豆片粉碎后 , 过 80 目筛并储存于 4℃下 密 闭 容 器 中 。豆 粉 蛋 白 质 含 量 为 ( 5515 ± 014) % , 氮 溶 指 数 8410%。树 脂 ( DEAE2sepharose fast flow)和柱子 ( 415 cm ×30 cm ) ,购自美国 GE公 司 。试剂为分析纯或更高级别 。 112 仪器
413
611
518
513
1015
组氨酸 ( H isd )
319
314
515
317
312
精氨酸 (A rg)
410
1119
2815
516
413
苏氨酸 ( Thrd )
的洗脱图谱 (见图 2) 。在洗脱图中 ,可观察到 6个主 峰 (分别标记为 1、2、3、4、5、6 ) 。与 Mori等 [ 8 - 9 ]研究 结果比较 ,本试验的洗脱峰数量多 1 个 ,即最后那个 小峰 (标记为 Unknown) ,此外第 1个峰和第 2个峰的 分离效果不如 Mori等人的 ,这可能是因为本试验上 样量远远大于他们的实验 (本试验上样量是其 10 倍 )。
- 210) 、A3 (管 220 - 240 ) 、A4 (管 241 - 263 ) 。因为 A1b被部分 B (碱性肽 )污染 ,所以不对 A1b进行收集 分析 。
将上述色谱技术得到的纯化多肽 (包括 A1a , A2 , A3 , A4 和 B )进行了进一步 SDS2PAGE分析 ,见图 5。 计算得 A1a , A2 和 A4 的分子质量约为 37 ku,而 A3 和 B 分 别 约 为 42 ku 和 18 ku。这 些 数 据 与 文 献 报
表 1 大豆球蛋白酸性肽和碱性肽的氨基酸组成 g/ (100 g) 样品
氨基酸
Ba
A1a a
A2 a
A3 a
A4 a
天冬氨酸 (A sp) 1110
1611
513
317
213
谷氨酸 ( Glu)
610
118
014
418
1011
丝氨酸 ( Ser)
513
216
718
318
310
甘氨酸 ( Gly)
凝胶成像系统 (W hite / U ltraviolet Tran Illum ina2 tor) ,美国 UVP公司 ; AKTA 蛋白质纯化仪 ,美国 GE 公司 ;垂直板电泳仪 ( PYCZ230) ,北京六一仪器厂 。 113 方法 11311 大豆球蛋白的制备
采用 N agano法 [ 10 ] 。将脱脂大豆粉按料水比 1∶ 15 ( g∶mL )分散 ,调 pH 至 715于室温下搅拌浸提 2 h, 然后 8 500 r/m in转速下离心 20 m in,取上清液 ,加入 亚硫酸氢钠 ,浓度为 0198 g /L ,调 pH 至 614, 4℃冷沉 10 h以上 ,在 4℃、1 000 r/m in离心 20 m in,沉淀物即 为大豆球蛋白 。 11312 大豆球蛋白组成多肽的分离纯化 [ 9, 11 - 12 ]
本研究通过对大豆球蛋白的组成多肽制备量小 问题的解决 ,为后期科学研究提供足够量的原料 。同 时对其氨基酸组分进行了分析 ,为相关研究提供理论 参考 。
第一作者 :硕士 (杨晓泉教授为通讯作者 ) 。 3 国家自然科学基金项目 ( 20776050) ;广东省自然科学基金项目
(07006508) ;教育部高校博士点基金 (20070561059) 收稿日期 : 2009 - 05 - 25,改回日期 : 2009 - 09 - 03
2009 年第 35 卷第 11 期 (总第 263 期 ) 145
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTR IES
上样 10 g的总回收率约 75% ,略低于之前 Wolf[ 9 ]上 样 1g的 90%。可见 ,回收率的差异可能是由于上样
量不同造成的 。然而 ,利用此色谱分离技术分离得到
的多肽量已经远远大于以前分离方法所得 ,给后期大
豆球蛋白的组成多肽物理化学及功能性质的研究打
下了坚实的基础 。
213 氨基酸组成
图 4 DEAE2Sepharose fast flow洗脱收集的 后 3个组分的电泳图谱
分离所得酸性肽和碱性肽的氨基酸组成列于表 1。这些多肽含有丰富的 Glu (谷氨酸 )和 A sp (天门 冬氨酸 ) ,这是一个典型植物种子蛋白的氨基酸组成 分布图 。然而 ,这 2种氨基酸的水平随多肽的类型而
2 结果与分析
211 大豆球蛋白制备 所得大豆球蛋白呈现出典型的酸性肽和碱性肽
的 SDS2PAGE电泳图谱 (见图 1) ,对应分子质量分别 约为 35 - 40 ku和 18 ku。光密度扫描结果显示酸性 肽和碱性肽之和占该泳道光密度强度的 95% ,即提 取的大豆球蛋白纯度达到 95%。纯度已适合进行下 阶段的研究 ,故未进行进一步的纯化 。
利用 DEAE2sepharose Fast Flow对大豆球蛋白中 的多肽进行分离纯化 。 10g大豆球蛋白溶于 90 mL 含有 610 mol/L 碳酰二胺 (尿素 )和 0102 mol/L 巯基 乙醇 、pH 值为 6145的 0105 mol/L 磷酸缓冲液中 ,即 为样品溶液 ,上样速度为 1 mL /m in。采用氯化钠溶 液为梯度洗脱液 ,其线性梯度浓度为 0 - 0135 mol/L , 流速为 5 mL /m in。根据洗脱液的 280 nm 吸光值所 体现的洗脱峰分别自动收集相应组分并于去离子水
大豆中蛋白质含量约为 40% ,根据沉降系数来 分 ,大豆蛋白可分为 2S, 7S, 11S, 15S 4个部分 。其中 7S和 11S占大豆蛋白总量的 70%以上 。 7S常称为 大豆伴球蛋白 , 11S称为大豆球蛋白 [ 1 ] 。
大豆球蛋白通常是分子质量约 35 万 u 的六聚 体 , 由 5 个 亚 基 ( A1a B2 , A1b B1b , A2 B1a , A3 B4 和 A5 A4 B3 )组成 ,每个亚基由一条 317 - 412 万 u 的酸 性肽 (p I < 7的多肽链 ,简称 A ,包括 A1a , A1b , A2 , A3 , A4 和 A5 )和一条约 2万 Da的碱性肽 ( p I > 7 的多肽 链 ,简称 B ,包括 B1a , B1b , B2 , B3 和 B4 )通过一个二硫 键连接 [ 2 ] 。前人已将 5 个亚基进行了分离 、纯化 [ 3 ] 并对氨基端氨基酸序列进行了表征 [ 4 ] 。国外科学家 对组成上述 5个亚基的酸性肽和碱性肽的分离方法 进行了许多研究 ,如 L iu[ 5 - 6 ]等采用在大豆球蛋白溶 液中加入巯基乙醇然后加热的方法 ; Kella[ 7 ]采用先 用巯基乙醇打开二硫键 ,然后利用离子交换填料对其 组成多肽进行选择性静态吸附的方法 。不难发现 ,以 上研究者分离得到的是酸性肽 、碱性肽的混合物 。 Moreira等 [ 4, 8 - 9 ]利用离子交换色谱分离方法对酸性 肽和碱性肽进行了分离 ,但是制备量太少 ,从而限制 了对其理化性质及功能特性的研究 。
图 1 Nagano方法提取制得大豆球 蛋白 SDS2PAGE电泳图谱
212 大豆球蛋白肽分离 、纯化 按照 11312中的层析条件 ,以 211中大豆球蛋白
为原料 ,经离子交换色谱分离 ,得到包含各洗脱组分
图 3 DEAE2Sepharose fast flow洗脱收集的 前 4个组分的电泳图谱
结合收集峰和电泳图谱 ,将纯的组分进行收集 。 具体为 : B (管 20 - 60) 、A1a (管 110 - 160) 、A2 (管 170
相对变化 。碱性肽的谷氨酸含量远低于酸性肽 (见
泳道 1 - Marker,泳道 2 - 大豆球蛋白 ,泳道 3 - B , 泳道 4 - A1a ,泳道 5 - A2 ,泳道 6 - A3 ,泳道 7 - A4
图 5 分离多肽的 SDS2PAGE电泳图谱
表 1) 。在酸性肽中 , A1a、A2 和 A3 的谷氨酸含量相 似 ,但远低于 A4 。至于天门冬氨酸 , A3 中含量最高 , A1a中含量最低 。碱性肽中的谷氨酸和天门冬氨酸含 量与 Mo 等 [ 6 ] 的 观 察 相 似 。A1a , A2 和 A3 (特 别 是 A3 )中谷氨酸的含量不同于 Moreira等 [ 4 ]的报道 。这 些差异可能是由于不同的多肽纯度和测定方法所引 起的 。
由于天门冬氨酸 /天门冬酰胺和谷氨酸 /谷氨酰 胺可以将酸性特性传递给蛋白质 [ 14 ] ,因此这些氨基
道 [ 8 - 9 ]一致 。光密度扫描技术分析得 : B , A1a , A2 , A3 酸的差异可能引起多肽在某些理化和功能特性方面 和 A4 的纯度分别为 9514, 100, 100, 9111和 111 ( To ta l 263 )
分离与提取
中 4℃透析 36h,中间换水 4次 ,然后真空冷冻干燥使 用。 11313 十 二 烷 基 钠 2聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 ( SDS2 PA GE )
SD S2PAGE电泳采用 Laemm li [ 13 ]的方法 ,选择分 离胶单体质量浓度为 120 g /L、浓缩胶单体质量浓度 为 40 g /L 的凝胶体系 。样品溶液与 SDS2PAGE 样品 缓冲液 (含有 5%巯基乙醇和 2% SDS) 直接相混合 (体积比为 1 ∶1 ) ,电泳前沸水浴 5 m in。上样量为 15μL ,凝胶电泳于恒流下进行 ,在浓缩胶中为 15 mA ,进入分离胶后增加至 20 mA。凝胶染色液采用含有 0125%的考马斯亮蓝 R2250,脱色采用高甲醇的醋酸 溶液 , V (甲醇 ) ∶V (醋酸 ) ∶V (水 ) = 277∶37∶263 。 凝胶染色以及脱色后 ,于凝胶成像系统进行成像处 理 ,同时进行光密度扫描分析 。 11314 氨基酸组成分析
图 2 大豆球蛋白的组成多肽 DEAE2Sepharose fast flow洗脱图谱
分别对不同收集管的收集样品进行 SDS2PAGE 分析 ,结果见图 3和图 4。结合图 2以及图 3和图 4, 不难发现 ,峰 1前部分为纯的碱性肽 ,而后部分与峰 2重叠 ,而资料 [ 8 - 9 ]显示 ,峰 2为 A1b ,峰 3为 A1a ,峰 4 为 A2 ,峰 5为 A3 ,峰 6为 A4 ,而标记为 Unknown的峰 6资料中未见说明 ,电泳图谱 (见图 4 )显示 ,其分子 量要比峰 6即 A4 要小 。