五氯柳胺混悬液中抗氧化剂焦亚硫酸钠含量测定

收稿日期:2018-03-15
基金项目:国家科技支撑计划项目(2015BAD11B01-01);国家肉牛牦牛产业技术体系(CARS-37)
作者简介:白玉彬(1991-),男,山东济宁人,硕士,主要从事兽医药理学与毒理学研究,(电话)176********(电子信箱)baiyb1011@;
通信作者,张继瑜(1967-),男,研究员,主要从事兽医药理学与毒理学研究,(电子信箱)infzjy@。

五氯柳胺(Oxyclozanide)属于水杨苯胺类药物,是一种氧化磷酸化解偶联剂,可降低寄生虫体内三磷酸腺甙(ATP)的合成量,从而导致虫体因能量代谢紊乱而最终死亡[1],该药对吸虫、绦虫和线虫均具有活性。

为满足兽医临床的需求,本实验室自主研发了五氯柳胺口服混悬剂,采用焦亚硫酸钠作为五氯柳胺混悬液的抗氧化剂,以提高制剂的稳定性[2-5]。

在溶液中焦亚硫酸钠会产生二氧化硫,从而生成亚硫酸盐对动物造成损害,控制焦亚硫酸钠的含量对提高产品的安全性具有重要的意义。

1材料与方法
1.1仪器
Agilent cary 100UV-Vis (Agilent Technolo⁃gies);KQ-600DE 数控超声波清洗器(昆山市超声仪
器有限公司);UPT-Ⅱ-40L 优普超纯水制造系统(上海优普实业有限公司);赛多利斯SQP 电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。

1.2试剂
无水亚硫酸钠(天津市滨海科迪化学试剂有限公司);酸性品红(国药集团化学试剂有限公司);冰乙酸(天津恒兴试剂);结晶乙酸钠(天津市北辰方正试剂厂);乙二胺四乙酸二钠(天津市大茂化学试剂厂);五氯柳胺混悬液(实验室自制,批号20171102、20171103、20171104)。

1.3溶液配置
1.3.1酸性品红溶液的配制
精密称量酸性品红
0.34g,加入1mL 硫酸,加水稀释并定容至1000mL。

1.3.2醋酸盐缓冲液(pH=4.8)的配制称取结晶乙酸钠136.1g,乙二胺四乙酸二钠0.4g,加入冰乙酸
五氯柳胺混悬液中抗氧化剂焦亚硫酸钠含量测定
白玉彬,董朕,张吉丽,周绪正,张继瑜
(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,兰州
730050)
摘要:为测定五氯柳胺混悬液中抗氧化剂焦亚硫酸钠的含量,根据焦亚硫酸钠在溶液中会缓慢释放出二氧化硫,二氧化硫在酸性条件下会使酸性品红溶液退色的原理,采用比色法在548nm 处测定吸光度,按外标法计算焦亚硫酸钠含量。

结果表明,无水亚硫酸钠在9.49~94.90μg /mL 线性关系良好,R 2=0.992;平均回收率为97.09%,RSD =0.6411%,表明该方法能够有效测定五氯柳胺混悬液中抗氧化剂焦亚硫酸钠的含量。

关键词:五氯柳胺混悬液;焦亚硫酸钠;比色法中图分类号:O656.9
文献标识码:A
文章编号:0439-8114(2018)13-0075-04DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2018.13.021
开放科学(资源服务)标识码(OSID ):
Content Determination of Sodium Pyrosulfite in Oxyclozanide Suspension
BAI Yu-bin ,DONG Zhen ,ZHANG Ji-li ,ZHOU Xu-zheng ,ZHANG Ji-yu
(Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730050,China)
Abstract :Content determination of sodium pyrosulfite in
oxyclozanide suspension.Sulffur dioxide released from sodium pyro⁃sulfite in solution can fade fuchsin acid solution.Absorbance was measured at the wavelength of 548nm by colorimetric method and content sodium pyrosulfite was calculated by external standard method.Anhydrous sodium sulfite showed good linearity(R 2=0.992)in the range of 9.49~94.90μg /mL;The average recovery was 97.09%with RSD =0.6411%.The method can effectively determine the content of the sodium pyrosulfite in the oxyclozanide suspension.Key words :oxyclozanide suspension;sodium pyrosulfite;colorimetric method
湖北农业科学2018年
57mL。

加水溶解并定容至1000mL。

1.3.30.04%乙二胺四乙酸二钠溶液的配制精密称量乙二胺四乙酸二钠0.4g,加水溶解并定容至1000mL。

1.3.4无水亚硫酸钠对照品溶液的配制精密称量无水亚硫酸钠10mg,加入0.04%的乙二胺四乙酸二钠溶液稀释并定容至50mL,配制成200μg/mL作为储备溶液。

精密量取储备溶液适量,依次使用0.04%的乙二胺四乙酸二钠溶液稀释为100、80、60、50、40、30、20μg/mL的对照品溶液。

1.3.5供试品溶液的配制精密量取1mL五氯柳胺混悬液于100mL容量瓶中,加入适量0.04%的乙二胺四乙酸二钠溶液,超声溶解,加0.04%的乙二胺四乙酸二钠溶液定容至100mL。

1.3.6辅料干扰溶液的配制精密量取1mL不含焦亚硫酸钠的五氯柳胺混悬液于100mL容量瓶中,加入适量0.04%的乙二胺四乙酸二钠溶液,超声溶解,并定容至100mL。

1.4测定方法的建立
1.4.1检测波长的选择精密量取酸性品红溶液2mL 于25mL容量瓶中,加入15mL醋酸盐缓冲液,共4份,分别加入醋酸盐缓冲液1mL(空白溶液)、辅料干扰溶液1mL、50μg/mL无水亚硫酸钠对照品溶液1mL、供试品溶液1mL,加醋酸盐缓冲液定容至刻度,摇匀。

以醋酸盐缓冲液为参比,在200~800nm 进行扫描。

1.4.2反应时间的选择精密量取酸性品红溶液2mL 于25mL容量瓶中,加入15mL醋酸盐缓冲液,加入50μg/mL无水亚硫酸钠对照品溶液1mL,加醋酸盐缓冲液定容至刻度,摇匀。

室温下放置5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60min,测定上述溶液在548nm处的吸光度,选择吸光度稳定的时间作为反应时间。

1.4.3专属性试验精密量取酸性品红溶液2mL 于25mL容量瓶中,加入15mL醋酸盐缓冲液,共2份,分别加入醋酸盐缓冲液1mL(空白溶液)和辅料干扰溶液1mL,加醋酸盐缓冲液定容至刻度,摇匀。

室温下放置45min,分别在548nm处测定吸光度。

测得空白溶液和辅料干扰溶液的吸光度,观察辅料是否会对测定结果产生影响。

1.4.4标准曲线精密量取酸性品红溶液2mL于25mL容量瓶中,加入15mL醋酸盐缓冲液,共7份,分别加入100、80、60、50、40、30、20μg/mL的对照品溶液,加醋酸盐缓冲液定容,摇匀,室温下放置45min。

以醋酸盐缓冲液作为参比,测定上述溶液在548nm处的吸光度。

以浓度为横坐标,吸光度的倒数为纵坐标,绘制标准曲线。

1.4.5重复性试验精密量取酸性品红溶液2mL 于25mL容量瓶中,加入15mL醋酸盐缓冲液,共6份,分别加入供试品溶液,加醋酸盐缓冲液定容,摇匀,室温下放置45min。

以醋酸盐缓冲液作为参比,测定上述溶液在548nm处的吸光度。

计算RSD, RSD不得大于2%。

1.4.6回收率试验精密称取4、5、6mg无水亚硫酸钠于100mL容量瓶中,加入0.04%的乙二胺四乙酸二钠溶液定容,摇匀,配制成40、50、60μg/mL的对照品溶液。

精密量取酸性品红溶液2mL于25mL 容量瓶中,加入15mL醋酸盐缓冲液,共3份,分别加入上述配制好的40、50、60μg/mL的对照品溶液,加醋酸盐缓冲液定容,摇匀,室温下放置45min。

以醋酸盐缓冲液作为参比,测定上述溶液在548nm 处的吸光度。

计算平均回收率及RSD。

1.5样品含量测定
精密量取酸性品红溶液2mL于25mL容量瓶中,加入15mL醋酸盐缓冲液,分别加入3批五氯柳胺混悬液供试品溶液,加醋酸盐缓冲液定容,摇匀,室温下放置45min。

以醋酸盐缓冲液作为参比,测定上述溶液在548nm处的吸光度,按照标准曲线法计算3批样品中的焦亚硫酸钠含量。

2结果与分析
2.1检测波长的选择
在200~800nm处对空白溶液、辅料干扰溶液、对照品溶液、供试品溶液进行扫描,结果显示最大吸收波长为548nm(图1至图4)。

200300400500600700800
波长//nm
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
图1空白溶液扫描图谱
图2辅料干扰溶液扫描图谱
200300400500600700800
波长//nm
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
76
第13期
表43批样品含量测定结果
批号20171102
2017110320171104吸光度0.56570.56620.56580.56860.56800.56800.56780.56810.5680
平均吸光度0.5662
0.56820.5680浓度//mg/mL
3.42
3.39
3.40
表2重复性试验结果
吸光度0.54030.53980.53990.53960.53950.5401
平均值
0.539867RSD //%
0.055775
表3回收率试验结果
浓度//μg/mL 60
5040吸光度0.48030.48020.48060.51630.51590.51610.58750.58770.5876
平均吸光度0.4804
0.51610.5876回收率//%96.4743
97.087197.7192平均回收//%97.09RSD //%
0.6411表1
不同显色时间溶液的吸光度
时间//min 吸光度
5
0.71410
0.65015
0.60920
0.576
25
0.553
30
0.541
35
0.534
40
0.530
45
0.529
60
0.529
50
0.529
图3
对照溶液扫描图谱
200
300400
500600700800
波长//nm
1.00.80.60.40.20.0图4供试品溶液扫描图谱
200
300400
500600700800
波长//nm
1.00.80.60.40.20.0
2.2反应时间的选择
分别以5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60min 作为显色时间测定吸光度(表1)。

由表1可知,在0~25min 吸光度变化明显,而在40~60min 吸光度较稳定,故选择45min 作为反应时间。

2.3专属性试验
在548nm 处测得空白溶液和辅料干扰溶液的吸光度均为0.875,表明处方中的辅料成分不干扰焦亚硫酸钠含量的测定。

2.4标准曲线
分别在548nm 处测定一系列对照品溶液的吸光度,以浓度为横坐标,吸光度的倒数为纵坐标,绘制标准曲线(图5),得标准曲线方程为y =0.023c +0.868,R 2=0.992。

2.5重复性试验
按照供试品溶液配制方法配制6份样品溶液,在548nm 处测定吸光度(表2)。

由表2可知,RSD 为0.055775%,证明其重复性较好。

2.6回收率试验
在548nm 处测定40、50、60μg /mL 对照品溶液的吸光度(表3)。

由表3可知,平均回收率为97.09%,RSD 为0.6411%,证明该方法准确度高。

2.7含量测定结果
按照上述焦亚硫酸钠测定方法,对3批五氯柳胺混悬液中的焦亚硫酸钠含量进行测定,结果见表4。

从表4中可以看出,3批样品中的焦亚硫酸钠的含量均接近3.4mg /mL,说明五氯柳胺混悬液性质稳定。

图5标准曲线
20
40
60
80
100
浓度//μg/mL 3.53.02.52.01.51.00.50.0
y =0.023x +0.868R 2=0.992
白玉彬等:五氯柳胺混悬液中抗氧化剂焦亚硫酸钠含量测定77
湖北农业科学2018年
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3小结与讨论
肝片形吸虫是寄生于肝脏胆管内所引起的一种较常见的人兽共患寄生虫病,该病分布广泛,在中国各地都有发生[6-8],然而对于驱吸虫的药物研究与开发,近年来一直没有突破性进展。

临床使用的药物,例如三氯苯达唑、氯氰碘柳胺等均已产生耐药性[9,10]。

五氯柳胺作为一种抗肝片吸虫药,对于五氯柳胺的耐药性国内外还未见报道。

五氯柳胺混悬剂研制成功,将对中国动物寄生虫病的防治发挥积极作用,尤其将改变中国在动物吸虫病防控中缺乏有效药物的局面,对促进畜牧业健康发展、保障公共卫生安全具有重要意义。

焦亚硫酸钠作为五氯柳胺混悬液的抗氧化剂,能够有效降低五氯柳胺混悬液的氧化作用,使其含量保持稳定,使制剂能够达到长期储存的目的。

但焦亚硫酸钠在溶液中会产生二氧化硫,从而生成亚硫酸盐,从而对动物造成损害,通过对抗氧化剂焦亚硫酸钠的含量测定,对于五氯柳胺的新药研发、应用以及食品安全控制具有重要的意义。

在反应时间的选择试验中,文献[2,4]中反应时间均在25min,而本研究发现中,在25min 时,吸光度仍不稳定,证明酸性品红溶液中亚硫酸钠未能完全反应,而在45min 测定的溶液吸光度达到稳定状态,证明亚硫酸钠反应完全,所以将反应时间定为45min。

同时对样品溶液的加入量进行了筛选,固定酸性品红溶液为2mL,分别加入0.5、1.0、2.0、3.0mL 样品溶液,在548nm 处测定吸光度,结果发现,当样品加入量为1.0mL 时,吸光度在0.2~0.8,测得的误差较小,所以将样品加入量定为1.0mL。

在方法学验证中,连续对6份供试品溶液进行测定,测得吸光度RSD 为0.055775%,证明该方法重复性好;标准曲线为y =0.023c +0.868,R 2=0.992,线性关系好;平均回收率为97.09%,RSD 为0.6411%,证明该方法准确度高。

通过分析方法结果验证来看,该方法专属性强、准确度高、线性关系好,可用于五氯柳胺混悬液中抗氧化剂焦亚硫酸钠含量的测定。

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