教育部科学技术研究重点项目申请书

所属学科（二级或以下）：临床兽医学
学科代码（二级或以下）：090603
项目编号：
教育部科学技术研究重点项目
申请书
v 200801
项目名称：过氧化物酶体增殖子活化受体γ对猪胚胎发育
与胎盘血管发生的影响
项目负责人：杨青
联系电话：*************移动电话：158****7595联系地址：湖南省长沙市芙蓉区农大路1号
邮政编码：410128
依托学校：湖南农业大学
填表日期：2011 年11 月27 日
教育部科学技术司制
二〇〇八年一月
填表说明
1．申请书为申报教育部科学技术研究重点项目的主要文件，一经立项，即为的项目执行的任务书。

各项内容须认真填写，表内栏目不能空缺，无此项内容时填“/”或“0”；
2．“项目名称”应简洁、明确，字数不超过30个汉字；
3．申请书第二部分有字数限制，第三~八部分表格可以拉长加页；
4．所在研究基地指申请人所在的国家或省部级实验室或工程（技术）中心等；
5．人才计划指获得以下人才计划资助者：长江学者、创新团队、跨（新）世纪人才、青年骨干教师培养计划，国家杰出青年科学基金、创新研究群体，百人计划，百千万人才工程（第一、二层次），省部级人才支持计划等；
6．申请书须加盖学校（部门）公章方为有效。

7．通过教育部科技管理平台提交项目申请书电子版本时，申请书中各签章页和附件部分（附件内容要求见申请书第十四款）须将原件扫描后，与申请书其他部分一并转换成pdf格式后通过教育部科技管理平台系统上传申报。

8．项目一经批复立项，须在规定时间内报送申请书纸质版（无需附件），书面材料均用A4纸双面打印，纸质封面装订。

二、项目概述（不超过800字）
猪的繁殖障碍是影响猪生产的一个重要因素，妊娠过程中死胎、弱仔和胚胎死亡的现象十分普遍，约30％～40％的胚胎在发育过程中死亡。

胎盘血管发生不足是导致胚胎死亡或胎儿发育迟缓的重要原因。

研究发现，过氧化物酶体增殖子活化受体γ（PPARγ）对鼠和人胎盘发育及胎盘血管发生具有重要影响，其缺失可导致小鼠胚胎在9.5～11.5 天间死亡。

这提示PPARγ也可能对猪的胎盘及胎盘血管的发生产生影响。

本项目将主要采用在体和离体的PPARγ激活或抑制实验，结合现代细胞分子生物技术与病理学检查手段，探索PPARγ对猪胎盘发育的组织结构及血管发生的影响，分析PPARγ对血管内皮生长因子VECF及其受体表达影响及其机理，并探讨PPARγ与猪胎儿发育迟缓的关联性，为防制妊娠过程中猪胚胎或胎儿死亡提供新的科学依据和理论。

三、立项依据（研究意义与必要性，国内外研究现状及分析，并附主要参考文献目录）
大量的胚胎死亡是影响家畜繁殖率的重要因素之一。

家畜的自发性胚胎死亡率大约为30％-40％[1,2]，当母畜处于不良环境、营养缺乏、受疾病侵害等时候，胚胎死亡更为严重。

猪是多胎家畜，其胚胎死亡较常见，而且胚胎在发育的任何时期都有可能死亡。

母猪的胚胎死亡有两个高峰期，第一个胚胎死亡高峰期是发生在胚胎附着前后即妊娠的10-30天；另外一个高峰期是发生在妊娠中期也就是妊娠的50-70天[3,4]。

许多年来，人们试图通过营养调控、选育或鉴定与子宫容量和胎盘效率相关基因来提高窝产子数，均没有取得显著效果[5-7]。

研究也发现大约只有1.3%的胚胎死亡是由于染色体异常所导致，由遗传因素所造成的胚胎死亡只占很小的一个比例[8]。

对于胚胎死亡的具体机制还不是很清楚，但目前认为胎盘发育过程血管发生异常是一主要原因[9]。

围植入期囊胚的扩展是启动猪胎盘发生的一主要因素。

猪胎盘发生不同于人和啮齿类动物，其子宫腔上皮仍然停留在子宫腔表面，子宫内膜的基质细胞不发生蜕膜化，滋养层不浸润到母体子宫内膜而是不断扩展覆盖到母体子宫表面的大部分面积[10]。

胎盘发育异常导致的胎盘功能不全从而引起胎儿的丢失、宫内发育迟缓（IUGR）、出生重低、死胎以及断奶前的死亡和生长发育不良等后果。

猪胎盘的发育起始于猪囊胚的伸展，囊胚的伸展程度可能是控制胎盘大小和每个胎儿所占子宫空间的主要因素。

胎盘绒毛的主要细胞类型是滋养层细胞，在胚胎植入期间，绒毛滋养层细胞粘附到子宫内膜上皮细胞，绒毛滋养层细胞的生长、分化、迁移以及子宫内膜调节因子等都受到严格的控制[11,12]。

猪胚胎植入后，粘附在一起的滋养层-子宫内膜上皮发生折叠，胎儿和母体的血管形成，这种折叠和生成的毛细血管组成胎盘结构单元并影响其功能。

绒毛上皮在聚集在猪子宫腺体的开口处绒毛上皮聚集形成具有特定功能的绒毛皱褶（areolae),负责吸收和转运来自于子宫腺体的营养成分，而且绒毛皱褶间
和绒毛皱褶内有大量的血管发生，这可保证胎盘发生后满足胚胎发育所需的营养成分和氧份[13,14]。

在所能容纳的一定数量胚胎的母猪子宫内，每个胚胎形成各自的胎盘，子宫能满足胎盘扩张、和生长的空间大小将影响着子宫和胎儿的发育，从而影响胚胎的存活率[15-17]。

在妊娠30天之前，子宫对胎盘和胚胎的发育没有什么限制[16,17]; 但超过这个时期后，子宫容量开始发挥其作用，在妊娠50天左右时通过减少子宫内胚胎的数量而变得明显[17]。

过氧化物酶体增殖子活化受体γ（PPARγ）是一种核受体转录因子，目前发现有PPARα、β/δ和γ三个成员。

PPARγ主要在脂肪组织中表达，在脂类代谢过程中发挥着很重要的作用[18]。

PPARγ在胎盘中也有大量表达，研究表明PPARγ是小鼠胎盘发育所必须的，它能调节小鼠和人滋养层的分化，其缺失将导致小鼠胚胎在9.5天和11.5天间发生死亡，其主要原因就是胎盘血管形成的缺陷[19,20]。

在缺失小鼠胚胎胎盘中，绒毛迷路层（labyrinthine）结构混乱并维持有早期实质不成熟的特征[19]。

PPARγ在小鼠胚胎血管发生过程中起着主要作用，在妊娠早期，缺失PPARγ导致严重的胎盘发育异常；而在妊娠后期，用PPARγ激动剂罗格列酮激活PPARγ后能抑制血管形成因子如增殖蛋白proliferin （Prl2c2）和血管内皮生长因子VEGF而控制胎盘血管发生，揭示在妊娠后期PPARγ可通过调节与血管生成相关基因而终止血管的增殖[20]。

体内诱导激活PPARγ影响着胎盘形态的变化以及脂肪酸的聚集使胎儿发育迟缓[21]。

PPARγ在其他动物组织如妊娠围植入期猪子宫组织、猪子宫绒毛膜、狗胎盘和母羊的胎盘子叶都有较高的表达，提示它们在猪妊娠过程的作用[22-24]。

血管发生是从已存在的血管进一步生成新血管的过程，血管发生是胚胎发育中的关键事件，对胚胎的生长和发育起着至关重要的作用。

为满足猪胚的快速增长，胎儿胎盘通过增多与子宫内膜的接触面积而变大或通过增加血管密度，大多杂交品系的猪通过增大胎盘面积来满足对猪胚胎生长的需要，而我国的高产梅山猪则通过增加血管密度克服子宫容量的局限性来提供对猪胚胎的营养供给[26]。

目前许多的研究表明血管内皮生长因子VEGF家族在妊娠过程中起着重要作用：从妊娠的早期一直到后期，VEGF及其受体在猪母胎界面都有相当量的表达，它们与血管发生有着密切的关系。

VEGF主要由内皮细胞所分泌的一种糖蛋白，当与细胞膜上的特异受体VEGF-RI（Flt-1）或VEGF-RII（Flk-1/KDR）结合后便促进内皮细胞增殖、迁移、毛细血管的通透性以及血管管腔形成达受许多激素、核转录因子以及许多信号通路（如Wnt、TGF-β信号通路等）的调控[20,29,30]。

综上所述，虽已表明PPARγ在小鼠胎盘发育、人滋养层细胞的分化等过程中发挥着很重要的作用；在其他家畜猪羊胎盘中的高表达也提示其在动物繁殖中的作用，但对于PPARγ在家畜妊娠过程中与胎盘发育以及对同窝胎儿发育的影响还不清楚。

因此，本项目将以猪为动物模型，结合体内动物试验和体外细胞培养，研究PPARγ在猪妊娠不同时期与胚胎发育的关联性以及胎盘血管发生，并进一步研究PPARγ对猪脐静脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成以及VEGF分泌等的调节试图探讨其在血管发生的作用机制，上述结果将为探讨胚胎发育迟缓或胚胎死亡的机制提供理论依据，为提高家畜的繁殖力提供
实践指导。

主要参考文献
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四、研究目标及主要研究内容（研究目标、具体内容、技术关键和难点）
研究目标
本项目以猪为动物模型，结合在体离体实验，从机体水平、组织水平和细胞水平探讨PPARγ对胚胎发育和血管发生的影响及其可能的作用机制，试图从理论上为探讨胚胎发育迟缓或死亡的机制提供依据，同时也为提高家畜的繁殖力提供实践指导。

主要研究内容（具体内容、技术关键和难点）
具体内容：本项目主要从体内动物试验和体外细胞培养两个方面开展。

在体研究：1）整体研究PPARγ对胚胎发育以及血管的影响，主要从胎儿数量、胎盘宫内所占面积（胎间距）、胎儿发育情况（胎儿体重、大小）、以及胎盘和脐带血管密度方面来反应；2）妊娠不同阶段，PPARγ和VEGF在窝内发育不匀称（正常发育、发育迟缓或死亡）间胎盘以及相应脐带中的表达和定位变化。

离体研究：1）建立猪原代脐静脉内皮细胞（PUVEC）分离和培养体系；2）通过体外激活或抑制实验，研究PPARγ对VEGF及其受体含量变化的调节、脐静脉内皮细胞增殖、迁移以及脉管形成的影响。

技术关键和难点：建立在体激活或抑制PPARγ动物模型和猪原代脐静脉内皮细胞的分离和培养体系将是本项目中涉及到的关键技术和难点。

五、研究方案及可行性分析（研究方案，技术路线，组织实施方案及可行性分析）
研究方案
（1）PPARγ的在体激活或抑制对胎儿发育和血管发生的影响
30头性成熟的长大杂二元青年母猪，连续观察到有4个发情周期后，通过人工受精技术建立妊娠。

随机分为3组，每组5头，即对照组、PPARγ激动剂罗格列酮（3 mg/kg体重/天）处理组和PPARγ抑制剂双酚A型环氧树脂（30 mg/kg体重/天）处理组。

妊娠处理第18天开始至采样前的12小时结束。

指标观察：分别在妊娠30天和70天处死动物，从整体观测PPARγ对猪宫内胎儿发育情况包括胎儿数量、胎盘宫内所占面积（胎间距）、胎儿发育情况（胎儿体重、大小）、以及胎盘和脐带血管密度等。

材料收集：收集正常妊娠中发育不匀称性胚胎的胎盘（包括有绒毛、绒毛皱褶和子宫内膜）和对应的脐带用于实验。

每个样本分成三份用于RT-PCR、Western Blot以及石蜡切片包埋。

（2）PPARγ和VEGF在发育不匀称性胎盘和相应脐带中的表达定位
PPARγ和VEGF的检测用实时定量PCR（Real-time PCR）检测和Western Blot分别检测PPARγ、VEGF及其受体mRNA和蛋白在胎盘和脐带中的表达；用免疫组织化学（IHC）检测上述PPARγ、VEGF 及其受体在上述组织中的表达以及共定位情况。

（3）PPARγ对猪脐静脉血管内皮细胞（PUVEC）功能的影响
建立PUVEC的分离和培养体系，分别用PPARγ激动剂或抑制剂处理研究PPARγ对PUVEC功能的影
响。

主要从以下4个方面开展：1）用MTS法和流式细胞仪检测技术研究PPARγ对PUVEC增殖、细胞周期的变化（G1、G2 和S期细胞的分布百分比）及细胞的凋亡等的影响；2）运用Transwell小室研究PPARγ对PUVEC迁移的影响；3）通过Matrigel小管形成法显微镜下观察PPARγ对小管形成的情况；4）用ELISA检测PPARγ对PUVEC中VEGF。

技术路线
组织实施方案
本项目拟采用如下方法开展相关实验：
（1）实时定量PCR （从mRNA水平检测相关基因的变化）
（2）Western Blot （从蛋白水平检测相关基因的变化）
（3）免疫组织化学（从蛋白水平检测相关基因的定位及变化）
（4）石蜡切片（组织形态学观察）
（5）细胞体外培养技术（猪静脉内皮细胞的分离和培养）
（6）MTS 比色法（猪静脉内皮细胞增殖）
（7）流式细胞仪检测（猪静脉内皮细胞细胞周期变化及凋亡）
（8）Transwell小室试验（猪静脉内皮细胞迁移）
（9）Matrigel小管试验（小管形成）
（10）ELISA检测（检测VEGF变化）
可行性分析
本项目所提出的研究内容、实验设计、技术路线是在大量前期工作并全面掌握本领域基础理论和前沿动态、经过合理归纳和推理的基础上提出的。

针对胚胎死亡或胎儿发育迟缓等繁殖问题，国内外学者对此进行了大量的研究，近几十年来对于提高家畜的繁殖力一直未取得明显效果。

（1）项目研究的理论依据充分：近来的研究发现，PPARγ对小鼠胎盘发育具有重要的影响，PPARγ基因缺失小鼠的胎儿因胎盘发育异常而引起死亡，胎盘血管发生出现异常；研究也已证实在猪妊娠早期子宫内膜中有PPARγ表达，并发现其表达水平随妊娠时期、胎次不同而有差异。

这些发现提示PPARγ对猪胎盘发育、胎盘血管发生可能产生影响，也为开展本项目研究提供了理论依据。

针对这点，我们试图从整体、到局部组织以及细胞水平从面上探讨PPARγ对猪妊娠不同阶段胎儿发育和血管发生的参与程度，思路正确，方法可行.
（2）人员安排合理：项目主要研究人员自2002年以来相继开展了哺乳动物胚胎发育及其相关妊娠生理调控等方面研究，熟悉本研究所涉及的各项实验方法与技术，有很好的团队精神和创新能力，具备实施该项目的人力条件。

（3）实验室条件：本项目依托湖南省临床兽医学重点学科实验室，具备完成本项目所需要的主要仪器设备和实验条件。

另外本研究组与中国科学院动物研究所生殖生物学国家重点实验室、西北农林科技大学动物医学院以及美国斯坦福大学医学院妇产科系等研究单位有着良好的合作关系，能提供实验所需的一些特殊材料与设备如激光共聚焦成像系统，灰度扫描仪和荧光发光检测仪等，上述条件完全能确保本项目的顺利实施。

六、项目创新点
猪为上皮绒毛膜型胎盘的多胎动物，与人和啮齿动物的血绒毛膜型胎盘有较大的组织结构差异。

本项目围绕猪胎儿因不均称发育而出现的胎儿发育迟缓、死胎问题，针对影响胎儿与母体物质交换的血管因素，采用体内和体外实验、运用现代实验技术开展深入、系统的研究，探讨PPARγ对猪上皮绒毛膜胎盘血管发生及胎儿发育的影响，在国内外尚属首次，在同类研究中具有明显的特色。

七、申请人简历与已具备的研究基础
申请人简历
项目负责人杨青，2000和2003年于湖南农业大学获学士和硕士学位。

2007年获中国科学院动物研究所博士学位。

2006年10月至2010年6月先后在美国路易斯维尔大学，美国斯坦福大学医学院儿科系和妇产科系做博士后。

曾参与多项973子课题、国家自然科学基金重点和面上项目、中国科学院知识创新工程重大项目和美国国立卫生研究院（NIH）的资助项目R01等的研究。

主要从事多肽激素生理，卵巢发育，早产致病机理，胚胎植入以及家畜繁殖障碍机理等方面的研究。

已在相关领域期刊发表学术研究论文及国际会议摘要18篇，其中SCI收录17篇。

现为美国生殖学协会（SSR）、北美华人生物医药协会（CABS）和中国动物生殖生物学会会员。

发表文章情况（按时间顺序）：
1.Yin JC, Li GX, Li J, Yang Q, Ren XF. In vitro and in vivo effects of Houttuynia cordata on infectious bronchitis virus. Avian Pathology, 2011;40(5):491-498.
2.Yang Q, El-Sayed YY, Shaw GM, Fu J, Schilling J, Madan A. Second trimester serum cytokines in women who develop spontaneous preterm labor. Am J Perinatol. 2010; 27(1):31-36.
3.Yang Q, El-Sayed YY, Rosenberg-Hasson Y, Hirschberg DL, Nayak N, Schilling J, Madan A. Multiple cytokine profile in plasma and amniotic fluid in a mouse model of pre-term labor. Am J Reprod Immunol. 2009;62(5):339-347.
4.Yang Q, Whitten J, Bruce Ling, Nayak N, Schilling J, Jin J, Yu TT-S, Cohen H, Madan A. Plasma biomarkers in a mouse model of preterm labor. Pediatr Res, 2009; 66(1):11-16.
5.Yang Q, Chen SP, Wang HM, Zhang XP, Zhu C, Lin HY. Smurf2 participates in human trophoblast cell invasion during pregnancy by inhibiting TGF-β type receptor signaling. J Histochem Cytochem, 2009; 57(6):605-612.
6.Wang HM, Zhang BH, Y ang Q, Li C, Lin HY, Zhu C. Smurf2 participates in human cytotrophoblast cell invasion during pregnancy by inhibiting TGF-beta type I receptor signaling. Biology of Reproduction, 2008; Special Issue: Sp. Iss. SI, Pages: 217-217 Meeting Abstract: 693.
7.Zhang B, Yang Q, Lin H, Zhu C, Wang H. Smurf2, by targeting TGF-beta type E3 receptor, is involved in the invasion of human cytotrophoblast cells during early pregnancy.Reproductive Sciences, 2008;15(2): 05A-205A Supplement: Suppl. S Meeting Abstract: 514.
8.Yang Q, Lin HY, Wang HM, Wang HX, Zhang H, Zhu C. Expression of Smads ubiquitin regulatory factor 2 (Smurf2) in rhesus monkey endometrium and placenta during early pregnancy. J Histochem Cytochem, 2007; 55(5):453-460.
9.Zhang XP, Zhu C, Lin HY, Yang Q, Ou QZ, Li YC, Chen Z, Racey P, Zhang SY, Wang HM.Wild Fulvous Fruit Bats (Rousettus leschenaulti) Exhibit Human-like Menstrual Cycle. Biol Reprod, 2007;77(2):358-364.
10.Zhang H, Li QL, Lin HY, Yang Q, Wang HM, Zhu C.Role of PPARgamma and its gonadotrophic regulation in rat ovarian granulosa cells in vitro. Neuro Endocrinol Lett, 2007;28(3):289-294.
11.Zhang H, Lin HY, Yang Q, Wang HX, Wang HM, Chai KX, Chen LM, Zhu C. Expression of Prostasin Serine Protease and Protease Nexin-1 ( PN-1) in Rhesus Monkey Ovary during the Menstrual Cycle and Early Pregnancy. J Histochem Cytochem, 2007;55(12):1237-44.
12.Yang Q, Wang HX, Zhao YG, Lin HY, Zhang H, Wang HM, Sang QX, Zhu C. Expression of tissue inhibitor of metalloproteinase-4 (TIMP-4) in endometrium and placenta of rhesus monkey (Macaca mulatta) during early pregnancy. Life Sci, 2006;78(24):2804-2811.
13.Lin HY, Yang Q, Wang HM, Qi JG, Zhang H, Wang HX, Tsang BK, Zhu C. Involvement of SMAD4, but not of SMAD2, in transforming growth factor-beta1-induced trophoblast expression of matrix metalloproteinase-2. Front Biosci, 2006;11:637-646.
14.Wang HX, Wang HM, Lin HY, Yang Q, Zhang H, Tsang BK, Zhu C.Proteasome subunit LMP2 is required for matrix metalloproteinase-2 and -9 expression and activities in human invasive extravillous trophoblast cell line. J Cell Physiol, 2006;206(3):616-623.
15.Lin HY, Zhang H, Yang Q, Wang HX, Wang HM, Chai KX, Chen LM, Zhu C. Expression of Prostasin
and Protease Nexin-1 in Rhesus Monkey (Macaca mulatta) Endometrium and Placenta During Early Pregnancy. J Histochem Cytochem, 2006;54(10):1139-1147.
16.Zhu C, Wang HX, Wang HM, Lin HY, Yang Q, Zhang H. Regulation of matrix metalloproteinase-2 and-9 in the invasive extravillous trophoblast cell line by proteasome subunit LMP2 via NF-kappa B pathway. Biology of Reproduction, Special Issue: Sp. Iss. SI, Pages: 209-209, Meeting Abstract, 2005. 17.Wang HX, Zhao YG, Wang HM, Yang Q,Lin HY, Sang QX, Zhu C. Expression of adamalysin 19/ADAM19 in the endometrium and placenta of rhesus monkey (Macaca mulatta) during early pregnancy. Mol Hum Reprod, 2005;11(6):429-435.
18.杨青，薛立群，刘斌，刘杨，袁安文. 维生素E对附植前小鼠胚胎发育与一氧化氮生成的影响. 湖南农业大学学报, 2003;29(4):288-290.
已具备的研究基础：
项目负责人自2002年来在生殖生物学包括早期胚胎发育、胚胎植入、卵巢发育、早产等方面参与研究，主要包括：小鼠胚胎发育早期中NO含量变化（见发表文章情况18）；相关基因及信号通路在胚胎植入、胎盘发育中的作用（见发表文章情况5-16）；PPAR gamma在卵巢发育中的作用（见发表文章情况17）；早产致病机理研究（见发表文章情况2-4）；猪同窝胎儿不均称发育的差异性与母猪胎盘效率研究（未发表的数据）；项目组主要参与人员在畜禽疾病防治、动物保健以及营养等领域具有扎实的理论基础和长期的兽医临床实践经验。

以上这些为本项目提供了有利的相关研究基础，为本项目研究积累了相关理论知识，奠定了相关研究基础和研究技术保障。

八、项目进度安排及提供成果形式
项目进度安排
2012度：准备实验动物，建立妊娠，处理实验动物，完成PPARγ从整体水平对妊娠不同时期胚胎发育的影响和血管发生，整理实验结果。

2013度：完成PPARγ、VEGF及其受体在组织中的表达定位，建立PUVEC的分离与培养体系，整理实验数据。

2014度：完成PPARγ对PUVEC功能的影响, 整理数据，撰写研究论文，对本项目进行总结。

预期成果
（1）探明PPARγ对猪胚胎发育、胎盘和脐带血管发生的影响。

（2）明确猪在正常妊娠过程，PPARγ在窝内胚胎发育不同情况中胎盘和脐带的表达以及共定位。

（3）阐明PPARγ对PUVEC功能的影响，初探PPARγ对胚胎发育的调节机制。

（4）在本领域高影响力的刊物上发表研究论文5 篇以上（其中SCI 收录刊物上2 篇以上）。

九、项目经费预算（金额单位：万元）
十三、教育部科技司意见
负责人签章单位公章
20 年月日
十四、项目申请书附件内容说明
1．项目负责人主要论文（近5年内发表的代表性论文3－5篇）的首页及发表该论文刊物封面的复印件；
发表的5篇代表性论文首页。

2．承担省部级以上科研项目情况需提供项目批复函复印件；
主持项目
北京化工大学化工资源有效利用国家重点实验室开放课题2011.6-2013.5
3．获奖或专利情况需提供获奖或专利证书复印件；
无。

4．已产生的经济和社会效益情况需提供相关证明材料的复印件；
无。

5．人才计划证书复印件。

无.
网上申报时，上述材料与申请书的其他部分需一并转换成pdf格式后方可通过教育部科技管理平台系统申报上传。

附件1. 5篇代表性论文首页论文1：
教育部科学技术研究重点项目申请书 v200801 教育部科学技术司 21 附件2. 承担省部级以上科研项目情况需提供项目批复函复印件。